H.P.L.C. High Performance Liquid Chromatography

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1 Lezione H.P.L.C. High Performance Liquid Chromatography cromatografia liquida fase mobile allo stato liquido strumento costituito da: 1) riserva di fase mobile 2) filtro 3) sistema di pompaggio 4) sistema di iniezione del campione liquido 5) colonna 6) rivelatore 7) registratore 1

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4 1) FASE MOBILE SOLVENTE SINGOLO O MISCELA DI SOLVENTI caratteristiche: i solventi possono essere di polarità differente ma devono essere miscibili fra loro LA RISERVA PUO ESSERE COSTITUITA DA: 1 CONTENITORE (ISOCRATICA) O 2 O PIU CONTENITORI (GRADIENTE) 4

5 Requisiti della fase mobile bassa viscosità immiscibilità con la fase stazionaria capacità di solubilizzare il campione compatibilità con il rivelatore non corrosiva, non tossica, non volatile limpida, stabile, poco costosa, facilmente reperibile grado di purezza elevato 5

6 2) FILTRO Evita che bolle d aria e inquinanti (anche la polvere presente nell ambiente) possano entrare in colonna conseguenza: rivelatore danneggiato, non buona risoluzione in colonna. 6

7 3) SISTEMA DI POMPAGGIO caratteristiche fondamentali per realizzare separazioni veloci ed efficienti ampia gamma di flussi (0,5 10 ml/min) flusso costante e riproducibile resistenza a corrosioni indotte dai solventi utilizzati elevate pressioni in ingresso (fino a 6000 psi cioè 400 atm) 7

8 esempi di picchi cromatografici caratterizzati da risoluzione non soddisfacente 8

9 ELUIZIONE ISOCRATICA composizione e flusso della fase mobile (costituita da uno o più solventi) costanti nel corso dell intera analisi. ELUIZIONE IN GRADIENTE La composizione della fase mobile varia nel corso dell analisi secondo programmi definiti dall operatore. 9

10 diverse possibili programmazioni della composizione della fase mobile in gradiente vantaggi: migliore risoluzione in un tempo più breve migliore conformazione del picco (no scodatura) 10

11 possibili sistemi di pompaggio della fase mobile in colonna 11

12 possibili sistemi di pompaggio della fase mobile in colonna 12

13 4) Sistema di iniezione del campione liquido trasferimento del campione dalla siringa al loop serbatoio a volume definito campione iniettato senza interruzione del flusso della fase mobile 13

14 loop interno serbatoio montato nel corpo del rotore 14

15 loop esterno loop costituito da tubo capillare esterno al corpo della valvola 15

16 5) Colonna cromatografica parametri caratterizzanti: 1) lunghezza 1 cm cm 2) diametro interno 2-5 mm 3) tipologia della fase stazionaria 4) diametro delle particelle costituenti la fase stazionaria 3-10 m 16

17 Tipi di cromatografia condizionati dal tipo di interazione tra fase stazionaria, fase mobile e analita ripartizione adsorbimento (liquido-liquido) (liquido-solido) scambio ionico coppia ionica e a soppressione ionica esclusione 17

18 importanza della polarità della fase stazionaria questo fattore influenza sia l adsorbimento che la solubilità polarità: si intende la presenza, all interno di una molecola, di centri positivi e negativi dal cui tipo di localizzazione dipende il grado di polarità. Si intende anche la possibilità di polarizzazione e della formazione di legami idrogeno. In cromatografia di ripartizione e di adsorbimento la separazione degli analiti è influenzata dalle differenze di polarità che gli analiti stessi presentano. A seconda della polarità della fase mobile rispetto a quella stazionaria, si può operare in cromatografia in fase normale o in fase inversa. 18

19 Cromatografia in fase normale: la fase stazionaria ha una polarità maggiore rispetto alla fase mobile. Domanda: In questo caso vengono eluiti prima i composti a maggiore o a minore polarità??? Cromatografia in fase inversa: la polarità della fase stazionaria è minore rispetto alla fase mobile. E in questo caso?? 19

20 Riassumendo 20

21 CROMATOGRAFIA LIQUIDO-LIQUIDO Colonna impaccata con una fase di supporto sulla quale è adsorbita la fase stazionaria liquida immiscibile con la fase mobile. Il tempo di ritenzione degli analiti è influenzato dalla loro solubilità in fase mobile e stazionaria (coeff. rip.) e dalla loro polarità 21

22 Supporti utilizzati per l impaccamento della colonna: a) supporto poroso b) supporto pellicolare 22

23 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO Le molecole del campione vengono adsorbite in misura diversa dalla fase stazionaria, distribuendosi in modo selettivo tra la fase stazionaria e la fase mobile. I gruppi funzionali presenti nella molecola influenzano il fenomeno dell adsorbimento (legami idrogeno, dipolo-dipolo, forze di London). Il materiale adsorbente presenta a livello superficiale gruppi reattivi; il grado di interazione con i gruppi funzionali delle molecole di analiti è influenzato dalla geometria delle molecole stesse. In questo tipo di cromatografia è necessario tener conto di: - tipo del materiale adsorbente (silice o allumina) - dimensione delle particelle - area superficiale - geometria delle particelle (sferiche, irregolari, porose, pellicolari) 23

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25 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO 25

26 CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE Permette di separare i componenti di una miscela considerando la loro forma e dimensione, senza il coinvolgimento di interazioni di tipo chimico o fisico tra gli analiti e la fase stazionaria. 26

27 Alcune tipologie di colonne disponibili 27

28 6) RIVELATORE Compito principale è quello di monitorare la fase mobile all uscita della colonna, fornendo informazioni sulla presenza e sulla quantità dei composti eluiti. La scelta della tipologia di rivelatore dipende da alcuni parametri: rumore di fondo: oscillazione del segnale non attribuibile alla rilevazione del campione. Tale parametro dipende da: elettronica dello strumento, fluttuazioni di temperatura, variazione della composizione della fase mobile. limite di rilevabilità: concentrazione minima di soluto in grado di fornire un segnale almeno triplo rispetto al rumore di fondo. sensibilità: misura della variazione del segnale che consegue alla variazione di concentrazione del soluto. linearità: il segnale deve variare linearmente al variare della concentrazione. selettività: rivelatore selettivo per particolari classi di composti 28

29 DETECTOR UV 29

30 ESEMPI DI STRUTTURA E LUNGHEZZA D ONDA MASSIMA DI ASSORBIMENTO 30

31 Assorbimento della radiazione regolato dalla legge di Lambert-Beer A = bc A = assorbanza = assorbanza molare o coefficiente di estinzione molare (costante per un certo soluto ad una certa lunghezza d onda) b = cammino ottico nella cella di lettura c = concentrazione del soluto A = log (I o /I) I o = intensità del raggio incidente I = intensità del raggio emergente 31

32 DAD = Diode Array Detector 32

33 DETECTOR A FLUORESCENZA Il principio si basa sulla misura delle radiazioni emesse da alcune sostanze quando vengono eccitate con radiazioni UV 33

34 DETECTOR A INDICE DI RIFRAZIONE IR Indice di rifrazione di una sostanza = rapporto tra il seno dell angolo di incidenza e il seno dell angolo di rifrazione. 34

35 Esempi di applicazioni della tecnica HPLC nel settore alimentare 35

36 Tracciato HPLC/DAD di una miscela di sei standard di antocianidine in soluzione metanolica. 36

37 Esempio di spettro di assorbimento delle soluzioni standard di riferimento 37

38 Tracciato tridimensionale HPLC/DAD delle antocianidine identificate in un idrolizzato di fragole fresche 38

39 Tracciato tridimensionale HPLC/DAD, delle antocianidine identificate in un idrolizzato di mirtilli freschi 39

40 mg/kg Comparazione del contenuto di antocianidine totali in confettura di fragole preparata in scala lab. a ( C) e confetture del mercato , ,41 23,44 0 Conf. fragole lab. Conf.. fragole Santa Rosa Conf.. fragole Wilkin&Sons Di.Pro.Ve. - Università degli Studi di Milano 40

41 mg/kg Comparazione del contenuto di antocianidine totali in confettura di lamponi preparata in scala lab. a ( C) e confetture del mercato , , Conf. lamponi lab. A Conf. lamponi Rigoni di Asiago 5,57 Conf. lamponi Zuegg 25,02 Conf. lamponi Esselunga Di.Pro.Ve. - Università degli Studi di Milano 41

42 mg/kg Comparazione del contenuto di antocianidine totali in confettura di mirtilli preparata in scala lab. a ( C) e confetture del mercato , ,01 165, Conf. mirtilli lab. Conf. Mirtilli Esselunga Conf. mirtilli Santa Rosa Di.Pro.Ve. - Università degli Studi di Milano 42

43 mg/kg Comparazione del contenuto di antocianidine totali in confettura di prugne preparata in scala lab. a ( C) e confettura del mercato 69, ,54 0 Conf. prugne lab. Conf. prugne Hero Di.Pro.Ve. - Università degli Studi di Milano 43

44 mg/kg Comparazione del contenuto di antocianidine totali determinate su frutta fresca e prodotti del mercato , ,11 397,63 408,16 390, Fragole fresche Conf.. fragole Santa Rosa Conf.. fragole Wilkin&Sons 30,41 23,44 45,71 Bevanda di fragole Pago Conf. lamponi Zuegg Lamponi freschi Conf. lamponi Rigoni di Asiago 5,57 25,0246,20 Conf. lamponi Esselunga Mirtilli freschi Conf. Mirtilli Esselunga Nettare di mirtillo Paoli Conf. mirtilli Santa Rosa 205,44 165,68 Prugne fresche Prugne secche Saratoga Prugne cotte Valfrutta 6,93 5,36 4,54 Conf. Prugne Hero Di.Pro.Ve. - Università degli Studi di Milano 44

45 glicosidi della cianidina in buccia di mela cianidina-3-galattoside 45

46 Tracciato HPLC relativo ad estratto di vino Negramaro 46

47 Ocratossina A in 76 vini rossi D.O.C., I.G.T., V.D.T., esaminati dai LRAAA nel 2002 (mercato nazionale). >0,5 / 1 13% >0,2 / 0,5 24% >1 5% < 0,1 38% < 0,1 0,1 / 0,2 >0,2 / 0,5 >0,5 / 1 >1 0,1 / 0,2 20% F. Tateo, M. Bononi Survey on Ochratoxin A in wine. More data concerning bottled red wines. Bulletin de l OIV, (Sept.-Oct.), (2003). 47