TIPI di CROMATOGRAFIA

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5 Metodo di separazione che si basa sulla distribuzione degli analiti tra una fase mobile e una fase stazionaria. TIPI di CROMATOGRAFIA Eluizione degli analiti può avvenire: Capillarità Gravità Pressione Potenziale Elettrico CROMATOGRAFIA COLONNA PLANARE GC Scambio ionico CCE LC Adsorbimento SFC TLC Esclusione Ripartizione Carta Elettroforesi Fase Normale (fase stazionaria polare fase mobile non-polare) Fase inversa (fase stazionaria non-polare fase mobile polare)

6 CROMATOGRAFIA - Teoria Distribuzione degli analiti tra le due fasi Può essere descritta in modo semplice considerando il seguente equilibrio: A mobile A stazionaria La costante d equilibrio, K, è detta coefficiente di ripartizione ed è data da: K =[A] mobile /[A] stazionaria Il tempo che intercorre tra l iniezione del campione e l uscita dell analita dalla colonna per raggiungere il rivelatore è detto tempo di ritenzione (t R ). Ciascun analita nel campione avrà differenti tempi di ritenzione. Il tempo che impiega la fase mobile ad attraversare la colonna è detto tempo morto (t M ). Il termine definito fattore di ritenzione, k', è spesso utilizzato per descrivere la velocità di migrazione dell analita nella colonna. Viene spesso definito anche fattore di capacità. Per l analita A il fattore di ritenzione è dato da: k' A = (t R - t M )/ t M t R e t M si ottengono direttamente dal cromatogramma. Quando il fattore di ritenzione è < 1, l eluizione è talmente veloce che è praticamente impossibile determinare accuratamente il tempo di ritenzione. Fattori di ritenzione elevati (> 20) sono indice di lunghe eluizioni. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.

7 Per descrivere la separazione di 2 specie A e B in colonna è utile definire il fattore di selettività (α): α = k ' B / k ' A Nel rapporto si pone al denominatore la specie che eluisce più velocemente in modo tale che sia sempre α >1. Maggiore è questo rapporto e migliore sarà al separazione. Per ottenere delle ottime separazioni è necessario che i picchi siano stretti e simmetrici, è quindi necessario fare in modo che non si verifichino allargamenti di banda, scegliendo opportunamente le condizioni operative (eluente e fase stazionaria) e valutando anche l efficienza della colonna.

8 CROMATOGRAFIA Efficienza della separazione Due fattori contribuiscono a determinare la qualità della separazione di 2 componenti: Differenza fra i tempi di eluizione dei picchi (più sono distanti, migliore è la separazione) Larghezza dei picchi (più sono larghi, peggiore è la separazione) Un soluto che si muove attraverso la colonna cromatografica tende ad espandersi in forma approssimativamente gaussiana con deviazione standard σ. Maggiore è il tempo impiegato dal soluto per attraversare la colonna e più larga sarà la banda. Le comuni misure della larghezza sono: w 1/2 =larghezzaametàaltezza ew = larghezza all intersezione della linea di base con le tangenti tracciate lungo le parti più ripide del picco L equazione che descrive un picco gaussiano è: y = σ 1 2 ( x μ) 2 2 σ e 2π Da cui si può dimostrare che w 1/2 = 2.35 σ e w = 4 σ

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20 Eluizione isocratica e a gradiente Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante. Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

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22 Cromatografia di scambio ionico Scambio anionico A ph maggiore del pi (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. L eluizione avviene con [Cl - ] crescente o abbassando il ph (più difficile da controllare). Scambio cationico A ph minore del pi (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. L eluizione avviene con [Na + ] crescente o alzando il ph.

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24 Cromatografia di scambio ionico

25 Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso ph e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

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28 Gel filtrazione L interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).

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32 Gel filtrazione

33 Gel filtrazione Vantaggi Semplice Prevedibile Svantaggi Bassa capacità (piccoli volumi) Soluzioni non viscose

34 Determinazione peso molecolare

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43 Sepharose 4B Gluatatione S-transferasi proteina Proteine contaminanti di E.coli

44 Sepharose Gluatatione Gluatatione S-transferasi proteina

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47 Cromatografia a fase normale - Fase stazionaria polare, solvente meno polare -Solventipiù polari hanno maggiore forza eluente Cromatografia a fase inversa - Fase stazionaria apolare, solvente più polare -Solventi meno polari hanno maggiore forza eluente La cromatografia in fase inversa elimina la codatura dei picchi poiché la fase stazionaria ha pochi siti che possono adsorbire fortemente il soluto. È anche meno sensibile alle impurezze polari (come l acqua) nel solvente.

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