Cromatografia di scambio ionico su colonna

Transcript

1 S.A.G.T. Anno Accademico 2009/2010 Laboratorio Ambientale II A Dottoressa Valentina Gianotti Marco Soda Matricola num Cromatografia di scambio ionico su colonna La cromatografia è un metodo di analisi che, in generale, sfrutta la diversa affinità delle molecole nei confronti di due fasi diverse: quella fissa (un solido o un liquido su supporto inerte) e quella mobile. Esistono diversi tipi di cromatografia effettuati con metodologie differenti, si possono elencare infatti: Cromatografia di assorbimento; Cromatografia di ripartizione; Cromatografia a scambio ionico; Cromatografia ad esclusione; Cromatografia di affinità; Gascromatografia. Oggetto della nostra esperienza di laboratorio sarà la cromatografia a scambio ionico. Essa è stata sviluppata intorno alla metà degli anni '70, quando ci si accorse che si potevano separare miscele cationiche e anioniche in colonne di HPLC che avessero come fase stazionaria resine di scambio ionico. Questo processo di analisi ci permette di riconoscere e separare gli ioni di un campione attraverso uno scambio ionico che avviene tra la fase mobile, contenente il campione, e la fase stazionaria che si trova all'interno della colonna. Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina scambiatrice di ioni. Esistono due tipi di resine: gli scambiatori anionici e gli scambiatori cationici. Questi ultimi possiedono gruppi carichi negativamente e attraggono, quindi, molecole cariche positivamente. Come risultato di un'analisi di scambio ionico si ha un cromatogramma, cioè un diagramma che ci permette di identificare i componenti di una miscela e le loro quantità; per questo motivo questo tipo di cromatografia è usato sia per analisi qualitative che quantitative. Ogni sistema di separazione è determinato dalla distribuzione competitiva di un componente della soluzione tra una fase stazionaria ed una mobile (chiamata eluente) a loro volta in equilibrio tra loro.

2 Attraverso il supporto viene realizzata una migrazione differenziale delle diverse sostanze ottenendo quindi la loro separazione. Ciascun composto, a seconda delle sue caratteristiche chimico-fisiche, si ripartisce in modo diverso tra fase stazionaria e fase mobile, pertanto la scelta opportuna delle due fasi permette la separazione anche di sostanze che differiscono di poco fra loro. Fra i componenti della miscela (che costituisce il campione iniziale) alcuni saranno in grado di interagire più fortemente con la fase stazionaria venendone trattenuti, altri meno e di conseguenza saranno favoriti a interagire con la fase mobile. In definitiva, la cromatografia si basa sulla diversa ripartizione dei componenti da separare tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni componente con esse. La ripartizione di un componente nelle due fasi viene descritta dal suo coefficiente di ripartizione (K d ) che è dato dal rapporto tra la concentrazione del componente in una delle due fasi e la concentrazione del componente nell altra fase: Questo valore, ad una determinata temperatura, risulta costante e dipende dalla natura chimica del sistema e dallo stesso componente. Alla luce di queste considerazioni risulta opportuno scegliere le due fasi in modo che per gli analiti da separare i coefficienti di distribuzione siano più differenti possibili; infatti più è diverso il coefficiente di ripartizione di due sostanze e più efficace sarà la loro separazione. Premessa ESECUZIONE DELL ESPERIENZA Poiché utilizziamo tre cationi che hanno la stessa affinità per lo scambio cationico, risulta opportuno trasformare i cationi in anioni tramite HCl, formando quindi dei clorocomplessi. Per questo motivo useremo una resina a scambio anionico e non una a scambio cationico. Dal momento che il nichel non forma clorocomplessi, sarà il primo ad uscire dalla colonna; il cobalto invece forma clorocomplessi a ph molto acidi (intorno a 3-4) e per questo uscirà per secondo mentre l ultimo catione a defluire sarà il ferro che forma clorocomplessi a valori di ph maggiori di 5. Noi agiremo modulando il ph con HCl a diverse concentrazioni. All inizio useremo HCl 8 M per avere ph acidi e rendere stabili con la fase stazionaria il cobalto e il ferro. Alzando il ph a valore 4-5 il cobalto non sarà più stabile e uscirà, arrivati a ph 7 anche il ferro sarà eluito. Materiale utilizzato per la preparazione della colonna Colonna di vetro con rubinetto, becker, cilindri graduati, matracci, pipette Pasteur, 20 g di scambiatore anionico forte Amberlite CG 400, acqua deionizzata, 50 ml di NaOH 1 M, 100 ml di HCl 8 M.

3 Procedimento Porre la resina, già precedentemente trattata con NaOH 1 M e lavata più volte con acqua deionizzata, in un becker e aggiungere 50 ml di HCl 8M; Porre su agitatore e lasciare decantare. Aggiungere altri 50 ml di HCl 8 M e, mantenendola in sospensione, versiamo in più riprese la resina nella colonna. Ad ogni aggiunta apriamo il rubinetto per lasciare defluire l HCl e far sedimentare bene lo scambiatore. Ripetiamo le operazioni fino a raggiungere un altezza della colonna di circa 30 cm. Materiale usato per la cromatografia Provette in vetro, becker, cilindri graduati, pipette Pasteur, cartine tornasole, soluzione di Ni 2+ 0,5 M Co 2+ 1 M e Fe 3+ 0,2 M in HCl 6 M, 5 ml di HCl 8 M, 10 ml di HCl 6 M, 14 ml di HCl 4 M, 20 ml di HCl 0.5 M, acqua deionizzata. Procedimento Aggiungere 4 gocce della soluzione con i tre cationi in HCl nella colonna impaccata senza toccare lo scambiatore quindi procedere con l eluizione aggiungendo dapprima l HCl 8 M, poi l HCl 6 M, il 4 M, e infine i 20 ml di HCl 0.5 M. Mentre un componente del gruppo procede con le suddette aggiunte, si procede con la raccolta delle prime 50 gocce fuoriuscite dal rubinetto della colonna per stimare il volume di una goccia. In seguito si raccolgono frazioni di 10 gocce in ogni provetta di vetro. Terminate le aggiunte di HCl si procede a lavare la colonna aggiungendo acqua deionizzata fino ad avere un ph neutro. Materiale usato per l individuazione dei tre cationi Dimetilgliossina, NH 3, HCl concentrato, NH 3 forte, acqua deionizzata, becker e pipette pasteur. Procedimento Nelle prime provette raccolte aggiungiamo NH 3 per portare il ph a 8-9 e successivamente 1 ml di dimetilgliossima. In presenza di nichel si formerà una soluzione rosso vivo e procederemo con questa operazione fino a risposta negativa. Per trovare il cobalto aggiungiamo circa 2 ml di HCl forte; in presenza del catione si formeranno soluzioni di varie tonalità di blu. Come ultimo passaggio, per trovare il ferro, aggiungiamo alle ultime provette circa 3 ml di NH 3 forte. In presenza dello ione otterremo una colorazione dei campioni tendente al marrone. Alla fine di questa operazione diluiamo le provette con acqua deionizzata per portarle allo stesso livello e per meglio cogliere le variazioni di tonalità di colore; quest ultima operazione è indispensabile per costruire il cromatogramma.

4 CROMATOGRAMMA Il cromatogramma è un grafico in cui si riporta in ordinata la variazione di intensità del colore al passaggio degli analiti attraverso il rilevatore in funzione del tempo (nel caso della nostra esperienza in ascissa avremo i millilitri eluiti dalla colonna). Si ottengono dei profili a forma di picco o banda, che indicano che i tempi di permanenza delle molecole di una stessa sostanza in colonna non sono uguali. I picchi sono abbastanza simili a curve gaussiane. L area del picco cromatografico è proporzionale alla quantità di sostanza iniettata e alla sua concentrazione se vengono inseriti volumi costanti. Qualora le condizioni fossero identiche anche l altezza del picco sarebbe proporzionale alla quantità di analita. La posizione del picco sull asse delle ascisse invece è data dal tempo di ritenzione (o dal volume di ritenzione), che corrisponde al massimo del picco, cioè al momento in cui la più alta frazione di molecole di quella sostanza passa attraverso al rivelatore. Dal cromatogramma si possono avere informazioni sia qualitative che quantitative. Il tempo di ritenzione ci dà un'informazione qualitativa della sostanza in esame. Calcolando invece l'area sottostante la curva, attraverso l'altezza del picco e la sua larghezza, che è proporzionale alla massa della sostanza separata, ottengo un'informazione quantitativa. Come si può vedere il cromatogramma ha un'importanza notevole in questo tipo di separazioni. CALCOLO DEI PERAMETRI DELLA COLONNA Utilizzando il campione 0, contenente 50 gocce di eluente, ricaviamo il volume in millilitri di una singola goccia. Questa misurazione è indispensabile per sapere con precisione quanti millilitri di eluente sono stati estratti dalla colonna in ogni campione. Ricavato il volume di una goccia infatti mi basterà sommare ad ogni provetta (che, come sappiamo, contiene 10 gocce) 0,72 ml per conoscere il volume estratto dalla colonna nelle altre provette. Dopo aver calcolato il volume di una singola goccia sono in grado di poter misurare il volume di ritenzione, che corrisponde al picco di intensità rilevata per ogni ione.

5 Osservando i tempi di ritenzione è possibile effettuare un analisi qualitativa degli ioni individuati attraverso questa cromatografia. Come in tutte le altre tecniche cromatografiche la maggiore affinità con la fase stazionaria comporta un tempo di ritenzione maggiore. Ad influenzare il maggiore o minore tempo di permanenza in colonna concorrono, oltre al ph, anche la dimensione degli ioni e la loro carica; tutti questi fattori influenzano infatti l equilibrio degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Dopo avere rilevato degli standard ed avere attribuito ad ogni ione un tempo di ritenzione corrispondente alle condizioni dell analisi, è possibile individuare di quale standard si tratta confrontando i tempi di ritenzione degli ioni in esame con quelli degli standard.

6 = 14,4 ml provetta n 15 = 34,56 ml provetta n 43 NOTA: durante l esecuzione dell esperienza non è stato possibile rilevare un picco significativo per quanto riguarda il Fe 3+ e calcolare di conseguenza il suo volume di ritenzione. Infatti, nonostante dal 65 campione (50,4 ml di eluente estratto dalla colonna) in avanti sia stata osservata una leggera variazione di colore, essa non risulta così evidente da indicare un estrazione efficiente dello ione ferro che ritengo sia rimasto ritenuto dalla resina. E logico supporre che la causa principale della mancata estrazione del ferro sia legata ad uno scarso innalzamento del ph all interno della colonna; infatti, se il Cobalto forma clorocomplessi a ph acidi, lo stesso non lo si può affermare del Ferro che inizia a formare clorocomplessi a ph superiori a 5. Ulteriore conferma di questa ipotesi viene data dalla verifica del ph all interno dei campioni che mantengono valori piuttosto bassi anche dove si sarebbero potuti ipotizzare valori prossimi alla neutralità (in virtù delle aggiunte di HCl a concentrazione via via inferiore e del successivo lavaggio della colonna con l aggiunta di acqua deionizzata). Calcolo il volume corrispondete a C e che definiremo con la formula:

7 V e = 0.37 C max Laddove C max è la concentrazione corrispondente al volume di ritenzione. V e ci fornisce il volume corrispondente al 37% di intensità di ogni ione sul cromatogramma. V e Ni 2+ = 10,6 ml V e Co 2+ = 27,05 ml Calcolo il numero dei piatti teorici per ogni ione sfruttando la formula: Questo valore è molto interessante perché ci permette di valutare l efficienza della colonna, cioè la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande e, di conseguenza, picchi molto stretti. Se si aumenta N in una colonna cromatografica, diminuisce il numero dei piatti teorici su cui si distribuisce ogni sostanza; in altri termini, si accorcia il tratto di colonna su cui si distribuisce ogni sostanza. Quindi l efficienza di una colonna aumenta con il numero dei piatti: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul cromatogramma. Poiché ogni piatto teorico occupa il medesimo spazio nella colonna, il modo più semplice per aumentare il numero dei piatti consiste nell aumentare la lunghezza della colonna, così facendo però bisogna considerare che si avrebbe un notevole aumento dei tempi di ritenzione. Calcolo per ogni ione l altezza equivalente del piatto teorico con la seguente formula: Con H si intende l altezza della colonna di scambiatore espressa in millimetri. Anche questo parametro risulta adatto ad esprimere l efficienza di una colonna. Una colonna è tanto più efficiente (nei confronti di una determinata specie chimica), e fornisce picchi tanto più stretti, quanto minore è il valore di H. Il parametro H è indipendente dalla lunghezza della colonna e quindi è più adatto di N per confrontare le prestazioni di colonne diverse.

8 CALCOLO DEL VOLUME INTERSTIZIALE RELATIVO Tale volume è dato dal rapporto tra il volume della fase mobile all interno della colonna e il volume della colonna. Il volume occupato dalla fase mobile si misura eluendo un soluto non ripartito (noi abbiamo a disposizione i dati relativi al Nichel): in questo caso il volume di ritenzione equivale al volume interstiziale V i definito anche come volume di fase mobile all interno della colonna. Il volume totale invece viene calcolato con il rapporto tra l altezza della colonna espressa in cm e la sua area trasversale espressa in cm 2.