Chromatography is a mature technique now. Gary Christian, Analytical Chemistry,

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1 Chromatography is a mature technique now. Gary Christian, nalytical Chemistry, 6th Ed. (Wiley)

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4 Descrizione generale della cromatografia I metodi cromatografici sono accomunati dalla separazione di sostanze presenti in miscela attraverso l uso di una fase stazionaria e di una fase mobile. I componenti sono trasportati lungo la fase stazionaria dal flusso della fase mobile (Eluizione). La diversa ripartizione tra queste due fasi determina la separazione dei componenti. Fase stazionaria: fase fissa in una determinata posizione (o colonna o superficie planare) Fase mobile: fase che si muove lungo, o attraverso la fase stazionaria, trasportando con sé l analita Classificazione C. su colonna La fase stazionaria è contenuta all interno di un capillare e la fase mobile passa attraverso la fase stazionaria per gravità o per pressione. Cromatografia C. planare La fase stazionaria è supportata su una superficie piana e la fase mobile passa attraverso la fase stazionaria per capillarità.

5 Cromatografia di eluizione campione FSE MOILE + Colonna impaccata RILEVTORE SEGNLE CROMTOGRMM TEMPO

6 FSE MOILE 1. Il movimento lungo la colonna avviene solo quando il soluto si trova nella fase mobile 2. La velocità dipende quindi dal tempo che il soluto trascorre nella fase mobile La frazione di tempo è piccola per composti molto trattenuti (), mentre è grande per composti poco trattenuti (). La ripartizione di un soluto tra fase stazionaria e fase mobile determina quindi i tempi di eluizione, e la possibilità di separare miscele complesse.

7 CROMTOGRMM SEGNLE TEMPO Informazioni QULITTIVE Informazioni QUNTITTIVE POSIZIONE DEI PICCHI DIMENSIONI (LTEZZ E RE) DEI PICCHI NECESSIT DI VERE PICCHI EN DEFINITI

8 Velocità di migrazione dei soluti Dalla velocità relativa di 2 o più molecole da separare dipende l efficacia della colonna La velocità dipende dai rapporti di ripartizione dei soluti nella FM e FS Rapporto di ripartizione o coefficiente di ripartizione mobile stazionaria K=C S /C M C S =K C M Questa proporzionalità è valida in un ampio intervallo di concentrazione, ciò determina l indipendenza del tempo di eluizione dalla concentrazione

9 Tempo morto e tempo di ritenzione SEGNLE t M t R t M : tempo necessario ad una specie non trattenuta per attraversare una colonna Specie non trattenuta TEMPO t R : tempo che passa tra l iniezione di un campione in colonna e la comparsa di un picco sul cromatogramma Velocità media lineare del soluto e della fase mobile L v=l/t R u=l/t M

10 Coefficiente di ripartizione e velocità di migrazione K =C S /C M V = u x frazione di tempo che il soluto trascorre in FM v= u x numero di moli di soluto in fase mobile/numero di moli totali di soluto C M V M 1 v=u X C M V M + C S V S = u X C S =K C M 1 + C S V S /C M V M v= u X K V S /V M

11 Fattore di capacità, indice della velocità di migrazione del soluto Parametro che può essere calcolato sperimentalmente k = K V S v = u X 1 V M 1 + K V S /V M v = u X k 1 L/T R =L/T M x 1 + k k = t R - t M t M u=l/t M SEGNLE t M v=l/t R t R k ideale tra 1 e 5! TEMPO

12 Fattore di selettività, indice della velocità di migrazione relativa di due soluti Parametro che può essere calcolato sperimentalmente k = t R - t M t M K = K V S V M a= K K a > 1 a= (t R) - t M (t R ) - t M K = K V S V M SEGNLE t M t R k = t R - t M t M TEMPO

13 Geometria del picco e efficienza della colonna SEGNLE Fronting Tailing TEMPO Tailing e fronting sono prodotti da un coefficiente di distribuzione non lineare 1 2 variazione di geometria del picco detector Fase stazionaria Interfaccia di scambio SEGNLE flusso Fase mobile considerando che una molecola è capace di effettuare migliaia di trasferimenti fase mobile-fase stazionaria possiamo immaginare il picco come centrato sul valore effettivo di t R attorno al quale c è una distribuzione di errori casuali di percorso

14 Efficienza di una colonna cromatografica ltezza di un piatto teorico H Numero di un piatti teorici N N=L/H L L efficienza di una colonna è proporzionale ad N, quindi inversamente proporzionale all altezza di un piatto. t R L-1 L+1 H= 2 / L Picco asimmetrico (tailing) W TEMPO N= 16 (t R /W) 2 Intensità di colore = numero di molecole di analita N = 41.7(t R /W0.1)2/(/ )

15 Variabili che influenzano l efficienza di una colonna Velocità lineare della fase mobile Coefficiente di diffusione nella fase mobile (D M ) Coefficiente di diffusione nella fase stazionaria (D S ) Fattore di capacità Diametro delle particelle della fase stazionaria impaccata Spessore del film liquido sulla fase stazionaria Velocità lineare della fase mobile H Max efficienza cm/sec Cromatografia liquida colonne cm Gas-cromatografia fino a decine di m

16 Teoria dell allargamento della banda; equazione di Van Deemter H=/u + C S u + C M u Coefficiente di trasferimento di massa nella fase stazionaria: Film di liquido su particella solida - direttamente proporzionale a (spessore) 2, inversamente proporzionale a D S nel film Fase stazionaria solida direttamente proporzionale al tempo adsorbimento/desorbimento Diffusione longitudinale: direttamente proporzionale al coefficiente di diffusione più importante in GC che in LC supporto Fase stazionaria liquida o solida Fase mobile Coefficiente di trasferimento di massa nella fase mobile: inv. prop. a D M, funzione di (diametro particelle) 2 (diametro colonna) 2 e u Diffusione turbolenta La diffusione turbolenta diminuisce a flussi bassi di fase mobile L allargamento di banda può essere minimizzato dall utilizzo di particelle piccole e regolari (p.es. sfere)

17 PRMETRI DI UN COLONN CROMTOGRFIC Fattore di Capacità k = t R - t M t M Selettività α= K K Efficienza H= 2 / L N= 16 (t R /W) 2

18 Risoluzione di una colonna Sovrapposizione del 4% Sovrapposizione dello 0.3%

19 Classificazione generale Metodo specifico Fase stazionaria Tipo di equilibrio Cromatografia liquida (LC), fase mobile: liquido Liquido-liquido Liquido adsorbito su solido Ripartizione tra liquidi non miscibili Liquido, a fase legata Specie organiche legate a superficie solida Ripartizione tra liquido e superficie legata Liquido-solido Solido dsorbimento Scambio ionico Resina a scambio ionico Scambio ionico Esclusione dimensionale Liquido in interstizi di solido polimerico Ripartizione/setacciamento Gas-cromatografia, Fase mobile: gas Gas-liquido Liquido adsorbito su solido Ripartizione tra gas e liquido Gassoso, a fase legata Specie organiche legate a superficie solida Ripartizione tra gas e superficie legata Gas-solido solido dsorbimento

20 GC HPLC

21 COLONNE CPILLRI PER GC

22 COLONNE IMPCCTE PER HPLC