CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESSIONE

Transcript

1 CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA PRESSIONE Tipi di cromatografo Unità di pressione Fase mobile Rivelatori HPLC di adsorbimento HPLC di ripartizione

2 La cromatografia ad alta pressione HPLC (High Performance Liquid Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography) si basa sui principi generali della cromatografia d adsorbimento, di ripartizione, di scambio ionico ecc.; essa permette di analizzare miscele difficilmente risolvibili con le tradizionali cromatografie. Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all impiego di fasi stazionarie molto finemente suddivise allo scopo di realizzare una superficie di interazione molto grande ed un migliore impaccamento, questo comporta che la fase mobile attraversi la fase stazionaria della colonna ad una pressione molto alta per permettere una eluizione accettabile nel tempo. Per una simile tecnica cromatografica, la fase stazionaria, che presenta una granulometria generalmente compresa tra 5-10 mm, deve avere requisiti particolari per adattarsi al tipo di separazione da effettuare ed inoltre deve avere come requisiti indispensabili: a) essere stabile idroliticamente e termicamente; b) resistere all azione meccanica del flusso dell eluente.

3 Diversamente dalla gascromatografia, l HPLC non separa sostanze che si trovano allo stato di vapore, ma permette la separazione di tutte quelle sostanze che difficilmente possono essere vaporizzabili o che in ogni modo possano alterarsi ad una temperatura più alta di quella ambiente; si può affermare che la gascromatografia e l HPLC sono due tecniche cromatografiche che si completano a vicenda in quanto permettono di separare i costituenti di una qualsiasi miscela. I vantaggi dell HPLC possono essere cosi riassunti: 1. tempi brevi d esecuzione 2. riproducibilità delle condizioni sperimentali 3. le colonne possono essere usate più volte; 4. possono essere analizzate miscele di sostanze termolabili, esplosive e non volatili. 5. possono essere evidenziate piccolissime quantità di sostanze grazie all alta sensibilità dei rivelatori che si utilizzano; 6. semplicità d uso Mauro Sabella

4 SCHEMA DI UN HPLC Mauro Sabella

5 HPLC IN ISOCRATICA Mauro Sabella

6 HPLC A GRADIENTE Mauro Sabella

7 Le caratteristiche di uno strumento HPLC sono rappresentate nello schema a blocchi delle figure. II solvente opportunamente filtrato e depurato, viene inviato alla colonna; questa operazione viene effettuata tramite una pompa. Un flussometro, posto dopo la pompa, regolerà la quantità di eluente che, nelle condizioni d esercizio scelte, sarà immesso nella colonna. Prima della colonna cromatografica viene posto un iniettore, che permette l inserimento del campione sciolto in un solvente opportuno. Per evitare di danneggiare la fase stazionaria della colonna é opportuno eseguire una prefiltrazione, attraverso una analoga colonna più piccola posta in serie, contenente lo stesso tipo di fase stazionaria con una dimensione delle particelle più grande, allo scopo di eliminare le impurezze grossolane, le morchie e le particelle insolubili contenute nel campione da analizzare.

8 Alla fine della colonna cromatografia viene posto un adatto rivelatore che, attraverso il cromatogramma, darà indicazioni sull andamento della separazione. Nel caso in cui si opera in isocratica é sufficiente una sola pompa (figura 1), mentre nel caso in cui si opera a gradiente (figura 2), è necessario usare due pompe per mescolare i solventi ed inviarli alla colonna ad un valore controllato di pressione, le condizioni operative, in questo caso, verranno programmate in anticipo tramite un calcolatore che automaticamente effettuerà le operazioni necessarie. E importante osservare che, poiché l HPLC opera con un alto flusso di fase mobile e quindi in condizioni di alta pressione, tutto il sistema operativo deve essere adatto per lavorare in queste condizioni.

9 In particolare la fase stazionaria è posta in una colonna cromatografica fatta con un materiale adatto per sopportare pressioni elevate (generalmente sono d acciaio) e la colonna stessa deve essere inserita in una camicia all interno della quale sarà esercitata una pressione tale da equilibrare la pressione esercitata dalla fase mobile all interno della colonna. Nel caso di una HPLC di tipo preparativo, il rivelatore darà informazioni sulla separazione della miscela, per raccogliere le varie frazioni di eluito contenente le sostanze purificate. Nel caso in cui la separazione dei vari costituenti risulterà parziale, le frazioni raccolte che contengono i componenti puri verranno raccolte, mentre le frazioni che contengono ancora le sostanze in miscela verranno dirottate con un rubinetto ed inviate alla colonna per essere nuovamente cromatografate.

10 Oltre ai vantaggi precedentemente elencati per questo tipo di tecnica, l'hplc costituisce un sistema cromatografico altamente efficiente in quanto: - usa delle fasi stazionarie altamente perfezionate e molto versatili anche per separazioni particolarmente difficili, - usa rivelatori molto sensibili che vengono adattati al tipo di sostanza da separare; - usa un alto flusso delta fase stazionaria che porta ad una esecuzione molto rapida nel tempo ed efficace.

11 UNITÀ DI PRESSIONE UTILIZZATE PER L HPLC Per questa tecnica cromatografia, l unità di pressione utilizzata è il pascal (pa) 1 pascal = 1 newton/m 2 = 1x10 5 bar 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm 2 1 Megapascal (Mpa) = 10 bar = 9,869 atm = 10,1971 Kg/cm 2

12 FASE MOBILE Mauro Sabella Nell HPLC Ia fase mobile verrà scelta in funzione delle sostanze da separare e deve presentare alcune caratteristiche peculiari tali da non generare inconvenienti, fra queste: deve presentare una bassa viscosità, in quanto questo permette di operare, all'interno della colonna, in condizioni di pressione di eluizione non troppo elevata; deve essere degasificato prima dell'introduzione in colonna; la presenza di aria può modificare chimicamente le sostanze da separare oppure dare alterazioni nella risposta del rivelatore deve essere puro, perchè la presenza di sostanze estranee può danneggiare la colonna; deve avere una temperatura di ebollizione sufficientemente elevata per evitare fenomeni di volatilizzazione alle temperature usate durante l'operazione cromatografica.

13 I SISTEMI DI POMPAGGIO Le caratteristiche cui devono soddisfare le pompe impiegate per l HPLC sono molto restrittive e includono: o Generazione di pressioni maggiori di 6000 psi (lb/in 2 ) o Non generare un pressione pulsatile in uscita o Velocità di flusso variabili in un range di ml/min o La riproducibilità del flusso non deve variare più dello 0.5% o Resistenza alla corrosione verso una grande varietà di solventi Sono impiegati due tipi di pompe meccaniche: una del tipo a siringa guidata a vite oppure una pompa alternativa (o a pistone), mostrata in Figura 3. La prima produce un flusso senza pulsazione e la velocità del flusso è facilmente controllabile; ha però lo svantaggio di un alto volume di riempimento, che diventa un problema quando devono essere sostituiti i solventi.

14 POMPE PER HPLC Le pompe a pistone sono quelle più comunemente usate e sono costituite da una piccola camera cilindrica che è riempita e vuotata dal movimento di un pistone. Il pompaggio produce un flusso pulsatile che deve essere successivamente linearizzato. I vantaggi delle pompe a pistone sono un piccolo volume interno, la capacità di generare alte pressioni in uscita (superiori a psi), rapida adattabilità al cambiamento dei gradienti nel corso dell analisi, flusso costante e inoltre sono molto poco sensibili alla viscosità del solvente e alla pressione in testa alla colonna.

15

16 SISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE Sebbene nella cromatografia in fase liquida sia spesso usata l iniezione tramite siringa attraverso un setto costituito di materiale elastomero, questa procedura non è molto riproducibile e si può usare solo a pressioni di lavoro inferiori a 1500 psi. Nella iniezione stop-flow il flusso del solvente viene bloccato per permettere l asportazione di una piccola quantità di solvente in testa alla colonna e il caricamento del campione, sempre in testa, tramite una siringa. Comunque il metodo di caricamento più usato in HPLC è quello che usa il sampling loop, come mostrato in Figura 4. Questi dispositivi sono equipaggiati di loop intercambiabili di capacità variabile dai 5 ai 500 μl. La caratteristica principale del sistema di iniezione tramite loop è l alta riproducibilità dei volumi iniettati. 3

17 Sistemi di iniezione per HPLC.

18 SELEZIONE DELLA TECNICA HPLC

19 ELUIZIONE ISOCRATICA O IN GRADIENTE isocratica isocratica gradiente (più forte) (meno forte)

20 COLONNE PER HPLC Mauro Sabella Le colonne per HPLC sono di solito costruite in acciaio, ma esistono anche in vetro ricoperto di metallo impiegate soprattutto quando si lavora a pressioni inferiori a 600 psi. La lunghezza delle colonne varia da 10 a 30 cm e il diametro interno da 4 a 10 mm. Le colonne sono generalmente impaccate con particelle di diametro variabile dai 5 ai 10 μm. Colonne di questo tipo arrivano generalmente a contenere dai ai piatti per metro di lunghezza.

21 Recentemente sono state introdotte sul mercato microcolonne lunghe dai 3 ai 6.5 cm e aventi un diametro interno variabile da 1 a 4.6 mm. Queste colonne che sono impaccate con particelle di diametro variabile dai 3 ai 5 μm, contengono più di piatti per metro e hanno il vantaggio di una maggiore velocità operativa e di un minore consumo di solvente. Quest ultima proprietà è di notevole importanza perché i solventi ad alta purezza richiesti per questo tipo di cromatografia sono molto costosi. Con questo tipo di colonne vi sono esempi di separazione di 8 composti in un tempo di 15 secondi con una colonna lunga 4 cm con un diametro interno di 4 mm e impaccata con particelle di 3 μm di diametro. 6

22 Il più comune materiale usato per impaccare le colonne per HPLC è la silice, preparata per agglomerazione di particelle di diametro inferiore al micron sotto condizioni che portano a particelle più grandi con diametri altamente uniformi. Le particelle risultanti sono spesso rivestite con sottili film di composti organici, che sono legati alla superficie tramite legami chimici o fisici. Altri materiali usati per impaccare le colonne sono le particelle di albumina, di polimeri microporosi e resine a scambio ionico.

23 RIVELATORI PER HPLC Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti Solute properties: si misura una caratteristica del soluto Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) Spettrofotometrico IR Fluorimetrico Indice di rifrazione (RID) Elettrochimico (ED) Spettrometria di massa (MS)

24 RIVELATORI I tipi di rivelatori che possono essere utilizzati per l'hplc sono diversi, l'uso di ciascuno in relazione alla natura delle sostanze che debbono essere evidenziate. E' evidente che, qualunque sia il rivelatore usato, la fase mobile non deve in alcun modo interferire nella determinazione ed il rumore di fondo dello strumento non deve essere superiore al segnale più basso dovuto alle varie sostanze da analizzare. I rivelatori più comunemente usati sono: spettrofotometrici, (IR, UV ecc.), concentrazione minima rilevabile g/ml; fluorimetrici, concentrazione minima rilevabile g/ml; a indice di rifrazione, un rivelatore a bassa sensibiiità a ionizzazione di fiamma.

25 RIVELATORE SPETTROFOTOMETRICO UV-VISIBILE il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) basato sull assorbimento di luce nel range UVvisibile sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) sensibilità tipica: 0.1 ppb è un sistema non distruttivo

26 GRUPPI CROMOFORI Cromoforo Formula l max (nm) e aldeide -CHO amino -NH azo -N=N bromuro -Br carbossile -COOH chetone -C=O disolfuro -S-S estere -COOR etere -O etilene -C=C fenile -C 6 H 5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO nitrito -ONO nitrile -C=N nitro -NO forte

27 SCELTA DELLA LUNGHEZZA D ONDA La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: massimizzare sensibilità e specificità il solvente della fase mobile può causare shifts in l max (2-5 nm) controllare l assorbanza degli analiti nella fase mobile i solventi per fase mobile hanno cutoff (valore di soglia) nell UV operando sotto la lcutoff può: ridurre la sensibilità introdurre rumore sulla linea di base

28 RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE sensibilità tipica: 0. 1 ppm completamente aspecifico necessita di termostatazione accuratissima si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri) è un sistema non distruttivo basato sulla misura del indice di rifrazione dell eluato (tipico rivelatore bulk) non adatto con eluizione in gradiente

29 HPLC DI ADSORBIMENTO Mauro Sabella I principi su cui si basa la cromatografia di adsorbimento sono stati già trattati nella parte generale. Si può operare in fase normale o in fase inversa in funzione del materiale che si usa per la fase stazionaria. La fase stazionaria può essere caratterizzata, in relazione alla sua struttura fisica, in due categorie: materiale poroso sia in superficie che all interno contraddistinto in microporous, se la dimensione vana fra 5-10 mm; macroporous, se la dimensione varia fra mm materiale, di dimensione compresa fra mm, compatto nella parte interna e con una pellicola porosa in superficie dello spessore compreso fra 1-2 mm, che viene definito pellicular. I macroporous e i pellicular vengono generalmente utilizzati per cromatografie preparative. I materiali più comunemente utilizzati sono: gel di silice, allumina, poliamidi, cellulosa, acetato di cellulosa, chromosorb (polimeri del vinil- e divinilbenzene).

30 HPLC DL RIPARTIZIONE Per questo tipo di cromatografia la fase stazionaria é costituita da un liquido che può essere legato ad un supporto inerte fisicamente o chimicamente. Nel caso in cui la fase stazionaria è legata fisicamente, può verificarsi un trascinamento di essa da parte della fase mobile; per evitare questo, che porterebbe ad una cromatografia non perfettamente efficiente si usa saturare la fase mobile con la fase stazionaria. In generale per evitare trascinamenti della fase stazionaria si usa operare legando chimicamente la fase stazionaria inerte che in genere è costituita da gel di silice, in particolare vengono funzionalizzati in vario modo i gruppi silanolici (figura 3)

31

32 ALCUNI METODI DI FUNZIONALIZZAZIONE VENGONO RIPORTATI NELLO SCHEMA SEGUENTE:

33 Se si adopera come fase stazionaria silice legata chimicamente con gruppi funzionali (bonded phase chromatography) si può operare sia in fase normale che in fase inversa in funzione della polarità dei gruppi legati al supporto, si avrà così: fase normale: silice legata a gruppi cianopropilici; fase inversa: silice legata a -C 18, -C 8, -fenile. L ordine di polarità dei vari gruppi legati alla silice varia secondo la seguente scala di polarità: -CN > -NH 2 > -C(CH 3 ) 2 > -C 8 > -fenile Si può operare sia in fase normale che in fase inversa, tenendo conto del tipo di fase mobile da usare in funzione del tipo di fase stazionaria.