Indice. Introduzione alle metodologie biochimiche 1 (Martino Luigi Di Salvo, Roberto Contestabile)

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1 VII Indice Prefazione XII Capitolo 1 Introduzione alle metodologie biochimiche 1 (Martino Luigi Di Salvo, Roberto Contestabile) 1.1 La Biochimica, una scienza sperimentale Come si progetta, si esegue e si interpreta un esperimento Internet e la bioinformatica nella ricerca biochimica 9 Capitolo 2 Lavorare in laboratorio 11 (Maria Teresa Carrì) 2.1 Strumentazione di base Vetreria di laboratorio e materiale monouso Bilance Sistemi agitatori Sistemi termostatati ph-metri Cappe Centrifughe Le sane pratiche di laboratorio La normativa vigente La formazione La prevenzione Uso di cancerogeni e mutageni Uso di radioisotopi o di sorgenti di radiazioni ionizzanti 32 Scheda di approfondimento De morbis artificum diatriba 2.3 Come si prepara una soluzione 34

2 VIII Soluzioni Soluzioni stock e diluizioni Controllo del ph delle soluzioni 38 Scheda di approfondimento I tamponi del signor Good Scheda di approfondimento Ancora soluzioni! Esercizi 48 Capitolo 3 Metodologie per la produzione delle proteine ricombinanti 53 (Francesco Giansanti, Giuseppina Pitari, Maria Carmela Bonaccorsi di Patti, Rodolfo Ippoliti) 3.1 Strategie di clonaggio di sequenze codificanti Clonaggio di sequenza nota Clonaggio di sequenza ignota Sistemi per l espressione delle proteine ricombinanti Batteri Lieviti Cellule di mammifero Cellule d insetto Proteine di fusione Tipo e funzionamento dei tag Mutagenesi di sequenze codificanti Mutagenesi sito-specifica Mutagenesi casuale 81 Scheda di approfondimento Un esempio di esperimento di mutagenesi sito-specifica: la storia della famiglia delle GFP Capitolo 4 Metodologie per la purificazione delle proteine: tecniche di separazione 87 (Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo, Margherita Eufemi) 4.1 Estrazione delle proteine dalla fonte biologica Rottura delle cellule e omogeneizzazione dei tessuti Separazione di organelli o componenti subcellulari 92

3 IX 4.2 Metodi di frazionamento di miscele proteiche Tecniche di centrifugazione Metodi di precipitazione delle proteine Cromatografia Cromatografia a esclusione molecolare o gel-filtrazione Cromatografia a scambio ionico Cromatografia di affinità Cromatografia di ripartizione Cromatografia di adsorbimento Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) 120 Scheda di approfondimento La separazione magnetica (Dynabeads ) Capitolo5 Metodologie per la purificazione delle proteine: tecniche di analisi 125 (Maria Teresa Carrì) 5.1 Elettroforesi Elettroforesi di proteine Elettroforesi di acidi nucleici Dosaggi quantitativi Metodi spettrofotometrici Metodi radioisotopici Tecniche immunochimiche Anticorpi Western blot ELISA e RIA Immunoprecipitazione 156 Scheda di approfondimento Orientarsi nel mondo delle macromolecole: le metodologie dei punti cardinali Scheda di approfondimento La citofluorimetria a flusso Capitolo 6 Esempi di purificazione di proteine 161 (Maria Carmela Bonaccorsi di Patti) 6.1 Purificazione della DNA polimerasi di Thermus aquaticus 164

4 X Purificazione da Thermus aquaticus Purificazione da Escherichia coli Purificazione con His-tag da Escherichia coli Purificazione di una proteina di membrana, il trasportatore della serotonina Detergenti: proprietà e utilizzo Purificazione da cervello umano Purificazione da cellule di mammifero HEK293-TetOn 174 Capitolo 7 Metodi spettroscopici per lo studio delle proteine 177 (Fabio Altieri, Maria Carmela Bonaccorsi di Patti) 7.1 Spettroscopia di assorbimento UV-VIS La legge di Lambert e Beer Strumentazione Cromofori delle proteine Applicazioni Spettroscopia di fluorescenza Principi teorici Aspetti quantitativi Strumentazione Fluorofori Applicazioni Spettroscopia a luce polarizzata Principi teorici Dicroismo circolare Applicazioni del dicroismo circolare 210 Scheda di approfondimento Proteine fluorescenti: una tavolozza di colori a disposizione dei ricercatori Scheda di approfondimento La Real-Time PCR Capitolo 8 La cinetica enzimatica nello studio del meccanismo di reazione 221 (Giovanni Antonini) 8.1 Come funziona un enzima L energia di attivazione e la teoria dello stato di transizione 222

5 XI Classificazione degli enzimi Cinetica enzimatica allo stato stazionario La cinetica in stato stazionario e l equazione di Michaelis-Menten Il significato di K m, V max, k cat e del rapporto k cat /K m Valutazione sperimentale della cinetica allo stato stazionario La velocità iniziale e i limiti strumentali Il grafico di Lineweaver-Burk I metodi lineari e la minimizzazione non lineare a confronto Cinetiche enzimatiche con più di un substrato L inibizione enzimatica L inibizione enzimatica: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista La regolazione allosterica e l attivazione enzimatica 245 Scheda di approfondimento L utilizzo industriale degli enzimi Scheda di approfondimento Un esempio dell uso della cinetica enzimatica per dosare enzimi o substrati: i biosensori Scheda di approfondimento L importanza farmacologica degli inibitori enzimatici Capitolo 9 Metodi biochimici nell analisi delle interazioni molecolari 255 (Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo) 9.1 Analisi teorica degli equilibri di legame: equazioni e grafici Il legame a un unico sito Il legame a siti multipli La competizione di legame Il legame non specifico La cinetica di legame Analisi sperimentale degli equilibri di legame Metodi spettroscopici Metodi basati sulla separazione molecolare Risonanza plasmonica di superficie Metodi per l analisi delle interazioni proteina-proteina 278 Scheda di approfondimento Un equilibrio di legame vitale come l aria che respiriamo Indice analitico 291