Saranno effettuate lezioni frontali. Sono previste esercitazioni teorico-pratiche e seminari di approfondimento.

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1 DIPARTIMENTO DI SCIENZE DEL FARMACO Corso di laurea magistrale in Chimica e tecnologia farmaceutiche Anno accademico 2018/ anno BIOCHIMICA APPLICATA BIO/10-8 CFU - 2 semestre Docente titolare dell'insegnamento AGATINA CAMPISI campisag@unict.it Edificio / Indirizzo: Dipartimento di Scienze del Farmaco, Ed. 2, Viale Andrea Doria, 6, 95125, Catania Telefono: Orario ricevimento: Martedì e giovedì dalle ore 10:00 alle ore 12:00 OBIETTIVI FORMATIVI Conferire conoscenze ed acquisire competenze relative ai fondamenti logici delle varie metodologie e tecniche strumentali coinvolte nella sperimentazione biochimica e biomolecolare. Fornire gli strumenti cognitivi per seguire gli sviluppi della genetica molecolare e dei relativi protocolli per l'identificazione, il clonaggio con i suoi vettori, il sequenziamento e l'espressione genica che hanno rivoluzionato la conoscenza dei processi biologici a livello molecolare, contribuendo al carattere interdisciplinare del corso. MODALITÀ DI SVOLGIMENTO DELL'INSEGNAMENTO Saranno effettuate lezioni frontali. Sono previste esercitazioni teorico-pratiche e seminari di approfondimento. PREREQUISITI RICHIESTI Conoscenze di base di Biochimica, Biologia Molecolare e Chimica Fisica. FREQUENZA LEZIONI Obbligatoria (almeno al 70 % delle lezioni), in rispetto delle norme del Regolamento didattico d Ateneo e del Corso di Studio.

2 CONTENUTI DEL CORSO Principii della ricerca biochimica. Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici). Modelli di sperimentazione biologica: Animale intero, organi perfusi, sezioni di tessuto. Soluzioni tampone. Colture cellulari. Il laboratorio per colture di cellule. Sterilizzazione. Metodiche colturali: colture primarie, secondarie, linee cellulari. Medium di coltura. Separazione ed analisi delle popolazioni di cellule. Conta cellulare. Crio-conservazione. Citometria a flusso, FACS e MACS. Tecniche elettroforetiche: Principi generali. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine sieriche. Elettroforesi su gel: agarosio, poliacrilamide gel elettroforesi (PAGE e SDS-PAGE). Isoelettrofocalizzazione (IEF). Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative (colorazioni in gel e in seguito a blotting). Elettroforesi capillare. Tecniche cromatografiche per la purificazione, separazione, identificazione e analisi quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) PM: Principi generali. Cenni sulla TLC. Cromatografia a scambio ionico. Cromatografia ad esclusione, Cromatografia di affinità. HPLC e GC (fasi stazionarie, rivelatori e principali applicazioni). Spettrofotometria UV-Visibile: Richiami sulla natura delle radiazioni elettromagnetiche. Spettrofotometria UV-VIS (principi, strumentazione ed applicazioni). Spettri di assorbimento. Legge di Lambert-Beer e sue applicazioni quantitative. Concetto di retta di calibrazione. Dosaggio spettrofotometrico della concentrazione proteica. Applicazione della spettrofotometria nei dosaggi enzimatici. Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Chemiluminescenza. Citofluorimetria a flusso e cell sorting. Cenni di Luminometria. Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni. Tecniche elettrochimiche. Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori. Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching. Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica. Tecniche di spettrometria di massa per l analisi qualitativa e quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) peso molecolare. Principi generali e strumentazione (sorgenti e analizzatori). Tecniche per lo studio delle proteine: metodi per il sequenziamento, la determinazione della struttura secondaria e terziaria, e delle modificazioni post-traduzionali e mutazioni. Cenni di proteomica. Metodi di marcatura di molecole biologiche: Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività mediante scintillazione. Autoradiografia. Marcatura con sistemi non radioattivi.

3 Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray. Il corso include esercitazioni pratiche in laboratorio obbligatorie su alcuni degli argomenti trattati nel corso. TESTI DI RIFERIMENTO Wilson K., Walzer J.: Biochimica e biologia molecolare: principi e tecniche. Ed. Raffaello Cortina Editore. Ninfa A.J., Ballou D.P.: Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Ed. Zanichelli. D.L. Nelson, M.M. Cox: I Principi di Biochimica di Lehninger, VII Edizione 2018, Ed. Zanichelli. 3. Voet D., Voet J.V., Pratt C.W. Fondamenti di Biochimica. Edizione IV. Ed. Zanichelli. ALTRO MATERIALE DIDATTICO Il materiale didattico fornito a lezione verrà pubblicato sulla piattaforma Studium: PROGRAMMAZIONE DEL CORSO Argomenti 1 Principi della ricerca biochimica. Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. 2 Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; Modelli di sperimentazione biologica: Animale intero, organi perfusi, sezioni di tessuto. Soluzioni tampone. Colture cellulari. Il laboratorio per colture di cellule. Sterilizzazione. Metodiche colturali: colture primarie, secondarie, linee cellulari. Medium di coltura. Separazione ed analisi delle popolazioni di cellule. Conta cellulare. Crio-conservazione. Citometria a flusso, FACS e MACS 3 Centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici). Riferimenti testi Capitolo 1 Wilson K., Walzer J. da pag. 1 a pag. 27. Capitolo 2 Wilson K., Walzer J da pag. 69 a pag. 94. Capitolo 3 Wilson K., Walzer J.

4 4 Tecniche elettroforetiche: Principi generali. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine sieriche. Elettroforesi su gel: agarosio, poliacrilamide gel elettroforesi (PAGE e SDS-PAGE). Isoelettrofocalizzazione (IEF). Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative (colorazioni in gel e in seguito a blotting). Elettroforesi capillare. 5 Tecniche cromatografiche per la purificazione, separazione, identificazione e analisi quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) PM: Principi generali. Cenni sulla TLC. Cromatografia a scambio ionico. Cromatografia ad esclusione, Cromatografia di affinità. HPLC e GC (fasi stazionarie, rivelatori e principali applicazioni). 6 Spettrofotometria UV-Visibile: Richiami sulla natura delle radiazioni elettromagnetiche. Spettrofotometria UV-VIS (principi, strumentazione ed applicazioni). Spettri di assorbimento. Legge di Lambert-Beer e sue applicazioni quantitative. Concetto di retta di calibrazione. Dosaggio spettrofotometrico della concentrazione proteica. Applicazione della spettrofotometria nei dosaggi enzimatici. 7 Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Chemiluminescenza. Citofluorimetria a flusso e cell sorting. Cenni di Luminometria. 8 Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigeneanticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni. 9 Tecniche elettrochimiche. Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori 10 Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching. Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica. 11 Tecniche di spettrometria di massa per l analisi qualitativa e quantitativa di molecole a basso (metaboliti, farmaci, ormoni, etc.) ed elevato (acidi nucleici e proteine) peso molecolare. Principi generali e strumentazione (sorgenti e analizzatori). 12 Tecniche per lo studio delle proteine: metodi per il sequenziamento, la determinazione della struttura secondaria e terziaria, e delle modificazioni post-traduzionali e mutazioni. Cenni di proteomica. Capitolo 10 Wilson K., Walzer J. da pag. 439 a pag Capitolo 11 Wilson K., Walzer J. da pag. 475 a pag Capitolo 12 e cenni Capitolo 13 Wilson K., Walzer J. Capitolo 13 Wilson K., Walzer J. da pag. 573 a pag Capitolo 7 Wilson K., Walzer J. da pag. 287 a pag Capitolo 1 Wilson K., Walzer J. da pag. 18 a pag. 27. Capitolo 14 Wilson K., Walzer J. da pag. 611 a pag Capitolo 9 Wilson K., Walzer J. da pag. 395 a pag Capitolo 8 Wilson K., Walzer J. da pag. 341 a pag. 394.

5 13 Metodi di marcatura di molecole biologiche: Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività mediante scintillazione. Autoradiografia. Marcatura con sistemi non radioattivi. 14 Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray. Capitolo 14 Wilson K., Walzer J. da pag. 611 a pag Capitolo 5 Wilson K., Walzer J. da pag.165 a pag. 170 e da pag. 190 a pag Librerie geniche e librerie genomiche Capitolo 6 Wilson K., Walzer J. da pag. 221 a pag VERIFICA DELL'APPRENDIMENTO MODALITÀ DI VERIFICA DELL'APPRENDIMENTO La verifica dell'apprendimento è costituita da una prova orale. Per gli studenti frequentanti il corso è prevista una prova di verifica in itinere con domande a risposte aperte. La prova, superato il punteggio minimo di 18/30, concorrerà alla valutazione finale. La valutazione finale (voto d esame) verrà effettuata in base alla pertinenza delle risposte rispetto alle domande formulate, alla qualità dei contenuti, alla capacità di collegare gli argomenti oggetto del programma, alla capacità di formulare esempi, alla proprietà di linguaggio tecnico e alla capacità espressiva complessiva dello studente. La valutazione finale (voto d esame) verrà effettuata in base alla pertinenza delle risposte rispetto alle domande formulate, alla qualità dei contenuti, alla capacità di collegare gli argomenti oggetto del programma, alla capacità di formulare esempi,alla proprietà di linguaggio tecnico e alla capacità espressiva complessiva dello studente. ESEMPI DI DOMANDE E/O ESERCIZI FREQUENTI 1. Colture cellulari. Tecniche elettroforetiche. Principi di base della fluorescenza. Tecniche di silenziamento genico. PCR. 2. Microscopio a fluorescenza e a scansione laser confocale. Citofluorimetro. MALDI e MALDI-TOF. HPLC. Western Blot.

6 3. Cellule staminali. Produzione di anticorpi policlonali e monoclonali. Tecniche di clonaggio. Proteine terapeutiche. ELISA.