03/11/15. Metodi vigorosi

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1 Metodi blandi Lisi cellulare con detergenti Metodi vigorosi 1

2 1. Centrifugazione preparativa Centrifugazione preparativa permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare 2. Ultracentrifugazione analitica C e n t r i f u g a z i o n e a n a l i t i c a utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati FRAZIONAMENTO CELLULARE FRAZIONAMENTO CELLULARE Separazione su gradiente di densita Separazione su gradiente di densita Microscopia Il campione viene fatto stratificare su un gradiente preformato la cui densita massima non deve superare quella delle particelle piu dense da separare Campo centrifugo campione G R A D I E T E Nota: Gli organelli subcellulari che hanno densita differenti ma dimensioni simili non sono ben separati con questo metodo Particelle a bassa densita Particelle ad alta densita la corsa deve essere terminata prima che le particelle raggiungano la base del tubo Becker. Il mondo della cellula VII edizione. Pearson 2

3 SPETTRO ELETTROMAGNETICO Proprietà del microscopio 1) Potere di risoluzione: distanza minima alla quale due punti sono distinti tra loro; max 0,2 micrometri 2) Ingrandimento: max 1000 X Microscopia: Principi distanza focale: 1. dipende da indice di rifrazione delle lenti; 2. dal mezzo in cui sono immerse; 3. dalla loro forma Ingrandimento è inverso della distanza focale Becker. Il mondo della cellula VII edizione. Pearson POTERE DI RISOLUZIONE: definito da D che dipende da 3 parametri: - Apertura angolare (α) o semiangolo del cono di luce che penetra nell obiettivo dal campione -indice di rifrazione (N) del mezzo situato tra il campione e l obiettivo - La lunghezza d onda (λ) della luce incidente Apertura angolare indice della quantità di luce che lascia il campione e passa attraverso le lenti. D = (K λ) / (N senα) Migliore potere risolutivo se D è valore piccolo In che modo si può diminuire D? - Diminuendo λ (blu, λ = 450nm) - Aumentando N: indice rifrazione aria=1; indice rifrazione dell olio da immersione 1,5 -Aumentando l apertura angolare (max 70, sen70 = 0,94) D=(0,56x450nm)/(1,5x0,94) 200nm=0,2µm 0,2µm = LIMITE RISOLUTIVO di un microscopio ottico utilizzando luce visibile Anche se si utilizzano lenti che permettono un maggiore ingrandimento, l immagine non è nitida perché si va oltre il potere risolutivo 3

4 IL LIMITE DI RISOLUZIONE IL NOSTRO OCCHIO RIESCE A PERCEPIRE COME SEPARATI DUE PUNTI SE DISTANO ALMENO 0.2 mm IL VALORE DI 0.2 mm VIENE QUINDI DEFINITO COME IL LIMITE DI RISOLUZIONE DELL OCCHIO UMANO MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO INGRANDIMENTO TOTALE: prodotto ingrandimento obiettivo X ingrandimento oculare MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO ROVESCIATO COLTURE CELLULARI PREPARAZIONE CAMPIONI: 1. FISSAZIONE CON ALCOOL O FORMALDEIDE (DISIDRATAZIONE) (in alternativa, congelamento) 2. INCLUSIONE IN PARAFFINA 3. FORMAZIONE DI SEZIONI SOTTILI AL MICROTOMO 4

5 Microscopia ottica: Preparazione del campione; fissazione e colorazione Cosa osservo al microscopio ottico: Mitocondri e cloroplasti (1µm) dovrebbero essere visibili ma tutti i componenti cellulari assorbono luce allo stesso modo quindi non sono sempre distinguibili Microscopia ottica in fluorescenza Fase finale della preparazione di un campione per microscopia ottica: COLORAZIONE Un composto chimico fluorescente assorbe luce ad una certa lunghezza d onda (λ di eccitazione) ed emette luce ad una specifica lunghezza d onda maggiore (λ di emissione) Nella microscopia a fluorescenza viene visualizzata la luce emessa dal campione 5

6 Spettri di fluorofori MICROSCOPIA CONFOCALE A SCANSIONE: permette di visualizzare le molecole fluorescenti su un solo piano focale, creando l immagine più nitida perché di una sola sezione Microscopio elettronico Potere di risoluzione max 0,1 nanometri PREPARAZIONE CAMPIONI: 1. FISSAZIONE con glutaraldeide (in alternativa, congelamento, microscopia crioelettronica) 2. FORMAZIONE DI SEZIONI SOTTILI con ULTRAMICROTOMO (0,1µm) Microscopia elettronica: Preparazione del campione Necessarie sezioni molto sottili; uso di metalli pesanti come coloranti 6

7 Microscopia elettronica a scansione: consente di osservare le superfici di campioni con sezionati max potere risolutivo 10nm Microscopia elettronica: Tecnica dell ombreggiatura metallica; vengono evidenziate le caratteristiche superficiali delle particelle. CITOFLUORIMETRO Basi della citofluorimetria a flusso q Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camera di flusso q Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza q Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila. q Es. Analisi di una sospensione di globuli bianchi contenente linfociti, monociti e granulociti q La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer granulocito linfocito monocito 7

8 Scatter Frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) Laser granulocito linfocito monocito Sensore per il FALS Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare. q Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantita di LUCE SCATTERATA nella DIREZIONE FRONTALE (lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Forward Scatter q L intensita del Forward Scatter e proporzionale alla DIMENSIONE, FORMA, ed OMOGENEITA OTTICA delle cellule (o delle altre particelle analizzate) Laser Scatter Laterale (90 Degree Light Scatter) monocito granulocito linfocito Sensore FALS Sensore per il 90 O LS Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello SCATTER LATERALE, a 90 gradi e che dà informazioni sulla DENSITÀ/ GRANULARITÀ (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser q Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita di LUCE SCATTERATA LATERALMENTE (perpendicolare all asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del Side Scatter q Anche l intensita del side scatter e proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneita ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate) Proprietà tipiche di Forward e Side Scatter q Il FORWARD SCATTER tende ad essere piu sensibile alle proprieta della superficie cellulare delle particelle e pertanto puo essere usato per DISTINGUERE CELLULE VIVE DA CELLULE MORTE q Il SIDE SCATTER tende ad essere piu sensibile alle inclusioni presenti all interno della cellula e pertanto puo essere usato per distinguere CELLULE GRANULATE da quelle NON-GRANULATE. 90 Degree Scatter Esempio di analisi dei leucociti e gating elettronico Forward Scatter Leucociti del sangue periferico si possono facilmente identificare tre popolazioni: - linfociti, - monociti - granulociti. Si puo disegnare un gate elettronico che permetterà in seguito l analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta 8

9 SISTEMA OTTICO DEL CITOFLUORIMENTRO I filtri dicroici, i bandpass filtri permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza d onda. cella di flusso filtri dicroici filtri bandpass Fotomoltiplicatori (PMT) I fotomoltiplicatori, raccolgono ed amplificano il segnale luminoso filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1 funziona come scatter a 90, e raccoglie la luce rifratta/diffratta ( scatterata ) dalle cellule. Raccolta della fluorescenza da una popolazione Laser Fluorescence detectors In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata fatta l analisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-cd3 (in FL1), anti-cd4 (in FL2) ed anti-cd8 (in FL3). Il Sorting cellulare FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Cellule singole separate dentro diverse provette FALS sensor Fluorescence detector Piastre cariche elettricame nte 9