Lenti e ingrandimento

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1 Microscopia

2 Lenti e ingrandimento q1 q2 Interfaccia sferica a g b R n1 n2 L s s N ) - (N N N ) ( N N N sin N sin b g a g b a b g q b b a q q q s' L, s L, R L g a b R N ) - (N s' N s N

3 Lenti e ingrandimento t a b A R b R a A` s C b C a S a -S a S b -S b n 1 n2 ( n2 n1) Sa S' a Ra n1 S' b n2 Sb ( n2 n1) Rb

4 ) 1 1 )( ( ' precedente abbiamo : quella sommando questa equazione a ) ( ) ( ' ' ' S' se t piccolo S a b b a b a b a b b R R n n S n S n Rb n n Rb n n S n S n S n S n Lenti e ingrandimento lenti" di i "costruttor equazione dei ) 1 1 )( ( 1 ' b a b a R R n n f n f S S

5 Fuoco di una lente F 1 F 2 Fuoco primario: è la posizione in cui l oggetto produce un immagine all infinito Fuoco secondario: è il punto in cui convergono i raggi che incidono paralleli sulla lente.

6 H Raggi principali: a) Raggio che passa per il fuoco della lente b) Raggio che passa per il centro della lente c) Raggio parallelo all asse ottico della lente V F 2 T T F 1 H H ' T ' m HT per similitudine dei triangoli HTV e H'T'V HT TV (distanza dell' oggetto H ' T ' T ' V per cui m (distanza dell' immagine H ' T ' HT T ' V TV s' s dalla lente : s) dalla lente : s') m s' s

7 Il Microscopio semplice qu Punto prossimo (250 mm circa) qm h qm M q u f

8 Il Microscopio semplice M q q m u q m h / f q u h / 250mm M 250mm / f

9 Il Microscopio composto Oculare (eyepiece) Obiettivo F oculare F obiettivo1 F obiettivo2 S ob S ob L oculare ingrandisce l immagine virtuale creata dall obiettivo Ingrandime nto dell' obiettivo: m s ob M f ob M oc quindi m ob m ob s' 250mm s' fobfoc ob ob ob Ingrandime nto dell' oculare : M Ingrandime nto complessivo : / f oc ob s' L / f ob oc / s ob 250mm/ f s' ob dettoanche lunghezza ottica del tubot (solitamente 160 mm) oc

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11 Piano focale = piano perpendicolare all asse ottico in cui le lenti focalizzano l immagine. Asse ottico = percorso lungo il quale la luce si propaga nel sistema

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13 Limite di risoluzione di un microscopio Figura di diffrazione di una fenditura

14 Limite di risoluzione di un microscopio Apertura circolare: d q q L d

15 Diffrazione da una fenditura (piccola, cioè non sia d>>λ ) d sinθ Sorgente puntiforme all infinito d θ θ Immagine della sorgente θ se qui d sinθ=λ qui è λ/2 Interferenza distruttiva Primo minimo a sin θ 1 = λ/d

16 Diffrazione da una fenditura (piccola, cioè non sia d>>λ )

17 Se la fenditura è circolare sinq d 2θ 1 rappresenta il diametro angolare dell immagine di un punto luminoso all infinito data da un sistema ottico (esente da aberrazioni) con diametro di apertura d 2θ 1 Una lente di dimensione finita si comporta come un diaframma (non fa passare luce per angoli maggiori della sua dimensione)

18 Disco di Airy

19 Vogliamo passare dal piano immagine a quello oggetto. Se P Q è la distanza minima tra i due punti immagine, quanto sono distanti P e Q? Qual è cioè la distanza minima risolvibile r min. Q B Differenza di cammino 1.22λ r min P a θ λ/d P A Q

20 Risoluzione: distanza minima risolvibile r min B AQ BQ ~ 1.22 λ 2 PQ sina ~ 1.22 λ Q r min = PQ ~ 1.22 λ/2sina a a a P A Se il mezzo in cui viaggiano i raggi diverso da aria λ--> λ/n n indice di rifrazione del mezzo tra l oggetto e la lente r min 0.61 nsin a

21 Massimo centrale Massimi secondari q q

22 sinq d

23 Potere risolutivo R Il primo minimo della curva blu è esattamente sul massimo della curva rossa criterio di Rayleigh la minima distanza tra i centri dei dischi di diffrazione di due punti affinchè questi siano distinguibili è uguale al loro raggio Il potere risolutivo (o separatore) R è l inverso dell angolo minimo sotto il quale due punti immagine devono apparire all obiettivo affinché essi siano distinguibili R ~ d/(1.22 λ)

24 Limite di risoluzione di un microscopio Criterio di Rayleigh: due immagini sono al limite della risoluzione (risolte) se il centro del massimo centrale di una figura coincide con il primo anello scuro dell altra. Vengono quindi separate da una distanza d uguale al raggio del disco di Airy

25 Limite di risoluzione di un microscopio D (0.61 N sin ) a N sina AperturaNumerica

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28 Dischi di Airy e Risoluzione Spaziale dischi di Airy più piccoli maggiore risoluzione spaziale risoluzione = capacità di distinguere 2 punti: vederli in maniera separata

29 Dischi di Airy e Risoluzione Spaziale Dischi di Airy grandi I due punti non sono risolti Dischi di Airy piccoli I due punti sono risolti

30 Dischi di Airy e Risoluzione Spaziale Basso AN Airy più grande minore risoluzione Alto AN Airy più piccolo maggiore risoluzione

31 NA & Airy Disc Size Airy più piccoli/ Migliore risoluzione Maggiore ingrandimento/an

32 Limite di Rayleigh OK Troppo vicino

33 Potere di risoluzione Leggi di risoluzione per gli obiettivi di un microscopio: d = 0.61 /NA obj d = distanza minima risolta in mm Quando AN del condensatore > AN dell obiettivo d = 1.22 /Na cond + NA obj d = distanza minima risolta in mm Quando AN del condensatore < AN dell obiettivo

34 Contrasto di interferenza differenziale Trasforma differenze in percorsi ottici in differenze in intensità, generando contrasto. OPL (lunghezza di passo ottico) = n*d n = indice di rifrazione d = distanza percorsa dall onda n.b. distanza percorsa dall onda è determinata dallo spessore del campione Spessore del campione e materiale contribuiscono all OPL n 1

35 Passo ottico N più grande OPL più lungo Campione più spesso OPL più lungo OPL dipende anche dalle lunghezze d onda

36 Passo ottico Passo ottico dei fronti d onda attraverso un campione in soluzione acquosa different optical path lengths! direction of light

37 Passo ottico D= differenza in passo ottico (D) possono dare un contrasto particolare t n 2 n 1 D = (n 1 -n 2 ) * t direction of light

38 DIC: contrasto interferenziale

39 DIFFERENTIAL INTERFERENCE CONTRAST

40 DIFFERENTIAL INTERFERENCE CONTRAST

41 DIFFERENTIAL INTERFERENCE CONTRAST

42 Obiettivo=20x (AN=0.4) ingrandito 10x Obiettivo=4x (AN=0.1) ingrandito 50x

43 Range di Ingrandimenti utili ( x AN dell Obiettivo) Obiettivo Oculare (NA) 10x 12.5x 15x 20x 25x 2.5X (0.08) 4X (0.12) 10X (0.35) 25X (0.55) 40X (0.70) 60X (0.95) 100X (1.40) x = combinazione buona x x x x x x x x x x x x x x --- x x x x x x x x

44 Limite di risoluzione di un microscopio 450nm (blu) N 1.5 (indice di rifrazione dell' olio) a 70 (massima apertura circolare per obiettivo) sin a 0.94 D (0.61* 450nm) 1.5* nm 0.2mm Per aumentare la risoluzione bisogna usare lunghezze d onda più piccole

45 Profondità di campo La profondità di campo rappresenta la distanza fra due piani, al di sopra ed al di sotto del campione da osservare, messi contemporaneamente a fuoco dall'obiettivo. È piuttosto evidente che, se il campione da esaminare ha un certo spessore e l'obiettivo ha una profondità di campo ridotta, si potranno avere delle difficoltà nella messa a fuoco La profondità di campo è inversamente proporzionale alla AN dell'obiettivo, per cui ad es. un obiettivo ad immersione 100X (AN 1,25) ha una PdC di 0,15 mm, mentre un obiettivo a secco da 25X (AN 0,40) ha una PdC di 0,4 mm.

46 Profondità di campo Durante l osservazione dei campioni citologici ed ematologici la PdC non rappresenta generalmente un problema perché spesso troviamo sul vetrino cellule disposte in monostrato. Profondità di campo totale: Dall altra parte dell obiettivo, in corrispondenza dell osservatore, si trova il piano di fuoco dell immagine: il range di messa a fuoco dell immagine è chiamato profondità di fuoco. Questo parametro ha importanza analoga al PdC, ma presenta una importante differenza: aumentando il potere di ingrandimento dell obbiettivo la PdC diminuisce, mentre la PdF invece aumenta.

47 Stereomicroscopia: bi-oculare Iluminazione Riflessa (Episcopica) Gli stereomicroscopi sono spesso utilizzati per esaminare campioni attraverso entrambi gli schemi di illuminazione:luce riflessa (episcopica) e luce trasmessa (diascopica). Si possono quindi utilizzare una serie di diverse sorgenti di luce e configurazioni. Spesso luce trasmessa e riflessa sono combinate in modo da mettere in evidenza questa o quella particolare caratteristica del campione. Illuminazione Obliqua Campioni che sono quasi trasparenti e senza colori risultano invisibili con stereomicroscopi diascopici. Se l illuminazione e diretta in modo da colpire il campione con un angolo obliquo si puo aumentare il contrasto.

48 Aberrazioni ottiche nelle lenti Aberrazione cromatica assiale Da luogo ad un alone colorato attorno al punto di fuoco.

49 Aberrazione sferica Da luogo ad un alone attorno al punto di fuoco.

50 Aberrazione comatica Se le lenti del microscopio non sono perfettamente allineate ed il raggio e fuori asse: e piu evidente per aperture numeriche grandi.

51 Astigmatismo

52 Aberrazione di curvatura di campo Superfici curve: l immagine risulta distorta secondo la curvatura della lente.

53 Distorsione geometrica Positiva Negativa

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55 Correzioni ottiche Achro and Achromat (acromatico), come Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, o Fluotar (fluorite) per correzioni sferiche e cromatiche Apo (apocromatico) per il più alto grado di correzione per le aberrazioni sferiche e cromatiche Correzioni per curvature di campo sono abbreviate come Plan, Pl, EF, Achroplan, Plan Apo, or Plano.

56 Stereomicroscopia: bi-oculare Iluminazione Riflessa (Episcopica) Gli stereomicroscopi sono spesso utilizzati per esaminare campioni attraverso entrambi gli schemi di illuminazione:luce riflessa (episcopica) e luce trasmessa (diascopica). Si possono quindi utilizzare una serie di diverse sorgenti di luce e configurazioni. Spesso luce trasmessa e riflessa sono combinate in modo da mettere in evidenza questa o quella particolare caratteristica del campione. Illuminazione Obliqua Campioni che sono quasi trasparenti e senza colori risultano invisibili con stereomicroscopi diascopici. Se l illuminazione e diretta in modo da colpire il campione con un angolo obliquo si puo aumentare il contrasto.

57 Magnification Aperture numeriche degli obiettivi Plan Achromat (NA) Plan Fluorite (NA) Plan Apochromat (NA) 0.5x n/a n/a 1x 0.04 n/a n/a 2x 0.06 n/a x x x x x (oil) n/a x x (oil) n/a n/a x (oil) x n/a n/a 0.90

58 Risoluzione ed apertura numerica per tipo di obiettivo Ingrandimento N.A Tipo di obiettivo Plan Achromat Plan Fluorite Plan Apochromat Risoluzione (&microm) N.A Risoluzione (&microm) N.A Risoluzione (&microm) 4x x x x x x N.A. = Apertura numerica

59 Luminosita dell immagine a (NA/M) 2 dove NA è l apertura numerica dell obiettivo e M è il fattore di ingrandimento

60 Correction Fattore di intensita luminosa dell obiettivo: In modo diascopico: F(dia) = 10 4 NA 2 /M 2 In modo episcopico: F(epi) = 10 4 (NA 2 /M) Magnification Numerical Aperture F(dia) F(epi) Plan Achromat 10x Plan Fluorite 10x Plan Apo 10x Plan Achromat 20x Plan Fluorite 20x Plan Apo 20x Plan Achromat 40x Plan Fluorite 40x Plan Apo 40x (oil) Plan Fluorite 60x Table 1 Plan Apo 60x (oil) Plan Apo 100x (oil) Plan Apo 100x (oil) Plan Apo 100x (oil)