Tecniche di isolamento

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1 Tecniche di isolamento

2 Considerazioni generali Spesso il primo passo verso un isolamento di successo è quello di imitare le condizioni ambientali in cui vive l organismo. Ad esempio per alghe marine che vivono vicino alla costa temperatura and salinità sono importanti, mentre la qualità delle acque ed i metalli pesanti lo sono per le alghe oceaniche.

3 Considerazioni generali Le alghe di acqua dolce sono meno sensibili alla temperatura, ma lo sono per quanto riguarda il ph. All opposto le alghe di ambienti polari sono sensibili alle temperature medio-alte e quelle da ambienti termali caldi alle temperature medio-basse. Le alghe da ambienti acidi o iperalini richiedono speciali terreni di colture, mentre quelle che provengono dai suoli o da altri ambienti terrestri sono poco sensibili ai fattori ambientali, ma possono richiedere particolari micronutrienti.

4 Inoltre ci sono particolari requisiti richiesti da alcune classi di alghe. Le Diatomee richiedono silicio, le Euglenoidi ammonio, alcuni generi (es., Chrysochromulina) necessitano di selenio. Le specie mixotrofiche (per esempio alcuni Dinoflagellati e Crisofite) spesso necessitano di batteri per poter crescere.

5 Il secondo passo necessario per un isolamento di successo implica l eliminazione delle altre specie presenti.

6 Il passo finale consiste nella crescita di subculture a partire da quella in cui l organismo è stato isolato. Non è raro che una specie non cresca più dopo una prima serie di trasferimenti in terreno di coltura nuovo. Questo di solito indica che il mezzo di coltura manca di qualche sostanza, oppure che durante la crescita l alga rilasci nel terreno sostanze che ne blocchino la crescita.

7 Metodi di campionamento La raccolta del campione è importante per il successo dell isolamento. Se nel campione sono presenti predatori (es. zooplancton) bisognerà stare attenti alla possibilità che la specie di interesse scompaia dal campione a causa dei predatori, prima che si sia fatto in tempo ad isolarla. Una filtrazione delicata può servire ad allontanare gli invertebrati. La filtrazione può anche servire per separare alghe di dimensioni diverse.

8 Camere di crescita per isolati Le celle climatiche sono molto usate per incubare le cellule isolate. Qualità ed intensità della luce sono molto importanti Alcune alghe richiedono cicli luce-buio e per questo è meglio usare sempre questi cicli quando non si conoscano le caratteristiche di un alga.

9 Mezzi di coltura Come abbiamo visto la selezione del mezzo di coltura è fondamentale. DI solito singole cellule preferiscono mezzi di coltura molto diluiti.

10 Poi si possono aggiungere a poco alla volta nutrienti adizionali per migliorare il tasso di crescita. Una volta che si sono ottenute colture dense, si può passare al re-inoculo su terreni non diluiti.

11 Colture di arricchimento Per isolare con successo un alga si può effettuare sul campione raccolto un pretrattamento usando terreno di coltura o estratto di suolo per verificare se questo non favorisca la crescita dell organismo di interesse. Questo passaggio è la cosiddetta coltura di arricchimento

12 Isolamento tramite micropipette Una volta che è stata ottenuta una coltura con un numero soddisfacente di cellule dell organismo da isolare, si può provare a prelevare una singola cellula con il sistema della micropipetta. Questo sistema prevede l uso di pipette Pasteur che vengono preparate secondo la seguente procedura

13 Estremità della pinzetta Pipetta pasteur Fiamma del Bunsen

14 Il diametro della micropipetta così ottenuta dovrebbe essere almeno il doppio dell organismo che si vuole prelevare. Se è minore la cellula può essere danneggiata, se è maggiore si rischia di prelevare anche altre cellule.

15 L isolamento comincia prelevando con un capillare una cellula dal campione di partenza. La gocciolina sterile contenente la cellula interessata, insieme ad altre, viene trasferita poi in un altra gocciolina che viene esaminata al microscopio. Il processo viene ripetuto tante volte fino a che non si isola la cellula che vogliamo separare dalle altre.

16 Il campione può essere posto in un qualunque recipiente adatto. Le goccioline di terreno sterile dovrebbero esse pronte prima che cominci l isolamento. E meglio depositare la gocciolina su agar, per ridurre l evaporazione.

17 Le gocce possono essere di acqua dolce o marina, sterili, o di un appropriato terreno di coltura.

18 La pipetta Pasteur deve prima essere immersa in un punto della soluzione in cui non c è la cellula da prelevare e poi spostata verso la cellula, in modo che la residua azione capillare consenta un prelievo delicato della cellula. L operazione viene effettuata al microscopio ottico invertito.

19 Microscopio invertito

20 Isolamento mediante colture su agar Per molte alghe del suolo o ad organizzazione coccoide la tecnica preferita è quella della striscio su agar.

21 Se nel campione originario ci sono funghi, diventa però molto difficile separarli dalle alghe

22 Alcune alghe vivono dentro l agar. In questo caso il campione naturale va posto in agar non solidificato e poi distribuito in capsule Petri. Bisogna usare Low-melting-point agar Le piastre vengono incubate alle condizioni opportune e si attende fino a che sono visibili le colonie. A quel punto una micropipetta viene immersa nell agar per prelevare la colonia interessata, che poi viene trasferita in un mezzo di coltura liquido.

23 Tecnica dello spray cell plate Un sottile spray di cellule può essere usato per inoculare piastre Petri. Lo spray si forma perché la sospensione liquida viene spruzzata mediante aria sterile che disperde le cellule lungo la superficie della piastra.

24 Tecnica di isolamento tramite diluizioni seriali La diluizione seriale è una delle più antiche tecniche usate per isolare alghe. Lo scopo è diluire una cultura fino ad ottenere un isolato unicellulare.

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26 DI solito conviene avere più provette per ogni punto di diluizione perché in un caso le cellule possono morire, in altre ci possono essere più cellule. La tecnica non consente di separare batteri da alghe

27 Isolamenti tramite gravità e centrifugazioni La separazione di cellule per gravità o centrifugazione può servire per separare CLASSI di organismi, sulla base delle loro dimensioni, ma non singole cellule

28 Isolamento tramite fototassi La fototassia è stata usata per separare flagellati dominanti in una cultura, che siano anche forti nuotatori..