Ingegneria Genetica e Microbiologia Applicata

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1 Corso di Laurea in Biotecnologie Anno Accademico Ingegneria Genetica e Microbiologia Applicata Percorso n 3: Clonaggio di segmenti di DNA Settima esercitazione - 13 maggio 2010

2 F

3 1 1 1: taglio con enzimi di restrizione 2 2: ligazione dei frammenti ottenuti 3 3: trasformazione di cellule di Escherichia coli DH5α

4 Il genere Burkholderia Stimolazione della crescita delle piante Biocontrollo Biorisanamento Produzione di composti ad attività antimicrobica Colonizzazione delle radici delle piante e fissazione dell azoto Endosimbionte in funghi ed insetti Genere Burkholderia Patogeno per gli animali Patogeno per le piante Patogeno per l uomo

5 Burkholderia cenocepacia J2315 E uno dei principali ceppi patogeni per i pazienti affetti da Fibrosi Cistica

6 Estrazione del DNA genomico Sostanze caotropiche come lo idrocloruro (GuHCl) e l isotiocianato (GuSCn) di guanidina, permetto al DNA di adsorbirsi a particelle di silicio. Differenti tipi di acido nucleico adsorbono più o meno bene alla matrice di silice, a seconda della forza ionica e del ph della soluzione. In ogni caso, l acqua distillata o un tampone a bassa concentrazione salina (TE 10/1 mm) sono in grado di eluire l acido nucleico dalle particelle di silice.

7 Estrazione del DNA genomico Protocollo 1. Da una piastra di cellule batteriche, viene effettuato, in condizioni sterili, l inoculo di una singola colonia, in 3ml di brodo LB all interno di un tubo batteriologico da 15 ml. Il tubo viene incubato ON a 37 C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. 2. Si centrifuga 1 ml di coltura batterica per 5 minuti a 8000 rpm

8 Estrazione del DNA genomico Protocollo 3. Si risospende il pellet in 180 µl di soluzione T1 4. Aggiungere 25 µl di proteinasi K (20 mg/ml) 5. Vortexare vigorosamente 6. Incubare a 56 C fino a lisi completa 7. Vortexare il campione

9 Estrazione del DNA genomico Protocollo 8. Aggiungere 200 µl di Buffer B3 9. Vortexare vigorosamente 10. Incubare a 70 C per 10 minuti 11. Vortexare brevemente

10 Estrazione del DNA genomico Protocollo 12. Aggiungere 210 µl di etanolo al 96 % 13. Vortexare vigorosamente 14. Trasferire il campione nella colonnina e centrifugare per un minuto a rpm 15. Eliminare ciò che è passato nel tubo collettore

11 Estrazione del DNA genomico Protocollo 16. Aggiungere 500 µl di Buffer BW 17. Centrifugare per un minuto a rpm 18. Eliminare ciò che è passato nel tubo collettore 19. Aggiungere 600 µl di Buffer B5 20. Centrifugare per un minuto a rpm 21. Eliminare ciò che è passato nel tubo collettore

12 Estrazione del DNA genomico Protocollo 22. Centrifugare per un minuto a rpm 23. Trasferire la colonnina in un nuovo tubino da 1,5 ml 24. Aggiungere 100 µl di Buffer BE 25. Incubare a temperatura ambiente per un minuto 26. Centrifugare per un minuto a rpm

13 Enzimi di restrizione di tipo II Tagliano all'interno del sito di riconoscimento, con modalità diverse. Tutti riconoscono una sequenza palindromica (che presenta un asse di simmetria binario: se letti da sinistra o da destra hanno stessa sequenza). Il n di basi conosciute può variare, in genere 4, 6, 8 o anche di più

14 Linearizzazione del vettore puc18 con l enzima di restrizione BamHI BamHI G GATC C Trattamento enzimatico del DNA genomico con Sau3A Sau3A GATC

15 Taglio con enzimi di restrizione Protocollo dh 2 O 2 µl (per portare a volume) DNA vettore 150 ng/µl 4 µl BUFFER 10X 1 µl ENZIMA (Bam HI) 10 u/µl 3 µl VOLUME FINALE 10µl Incubazione a 37 C per 3 ore e successiva inattivazione dell enzima a 80 C per 20 minuti

16 Taglio con enzimi di restrizione Protocollo d H 2 O (per portare a volume) DNA cromosomico 6 µl 100 ng/µl BUFFER 10X 1 µl ENZIMA (Sau III A) 10 u/µl 3 µl VOLUME FINALE 10µl Incubazione a 37 C per 3 ore e successiva inattivazione dell enzima a 65 C per 20 minuti

17 Ligasi T4 La DNA ligasi T4 è stata prodotta attraverso tecniche di DNA ricombinante ed è attualmente la più usata nelle manipolazioni del DNA. Richiede Mg++ e ATP come cofattori. Catalizza la formazione di legami fosfodiestere fra terminali 3 -OH e 5 -P adiacenti in molecole di DNA a doppio filamento. Non agisce sul ssdna. La concentrazione del DNA o, per meglio dire, la concentrazione delle estremità disponibili, sono un parametro critico per la buona riuscita di una ligazione e da esse dipende strettamente la velocità della reazione. Per rendere più probabile l incontro tra plasmide e inserto, si opera a un concentrazione di DNA dell inserto di 2-3 volte superiore a quella del vettore.

18 Ligasi T4 Formula che mi permette di calcolare i ng di inserto da utilizzare nella preparazione della miscela di ligasi per avere un certo rapporto molare tra vettore e inserto Vettore (ng) * Inserto (Kb) Vettore (Kb) Inserto * = Vettore Nanogrammi di DNA inserto da utilizzare

19 Preparazione miscela di ligasi Protocollo Campione BUFFER LIGASI T4 (2X) 5 µl puc18 1 µl DNA 2 µl LIGASI T4 1 µl d H 2 O 1 µl (per portare a volume) VOLUME FINALE 10 µl

20 Preparazione miscela di ligasi Protocollo Controllo negativo BUFFER LIGASI T4 (2X) 5 µl puc18 1 µl DNA - LIGASI T4 1 µl d H 2 O 3 µl (per portare a volume) VOLUME FINALE 10 µl Incubazione per 3 ore a temperatura ambiente e poi trasferimento a 20 C