Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4

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1 Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi mediante Real time PCR Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Ancona Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 2004: istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR coordinatore dr. David Lee (CEFAS) Definizione metodi di riferimento per NV (GGI e GGII) e HAV: Superfici Frutta e vegetali Acqua Molluschi bivalvi Roma Istituto - Superiore La Sapienza di Sanità Roma Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 PCR convenzionale vs. real-time PCR Stato dei lavori: - definizione metodo (PCR Real-Time) - modalità di estrazione dell acido nucleico - definizione protocollo (primers & sonde, reagenti, condizioni di retrotrascrizione e amplificazione) - definizione dei controlli (controllo di processo, controlli interni per l amplificazione) analisi end-point qualitiativa sensibilità: doppia PCR specificità: sequenziamento, ibridazione difficile standardizzazione analisi durante la reazione quali/quantitativa sensibilità: one-step specificità: probe standardizzabile Real-time PCR Concentrazione del virus virus controllo di processo Estrazione e purificazione RNA threshold Retrotrascrizione e PCR recupero (virus CP) inibitori (RNA) curve stnd

2 1. Preparazione del campione Pulizia esterna dei molluschi Apertura (min 10 individui) Prelievo dell epatopancreas Pulizia epatopancreas Sminuzzare finemente Prelievo di 2 g Aggiunta di 10 µl di controllo di processo (Mengovirus, FCV, etc.) Aggiunta di 2 ml di soluzione di proteinasi K (0.1 mg/ml) 37 C per 60 min con agitazione 60 C per 15 min Centrifugazione 3000 g per 5 min Recupero sovranatante e normalizzazione volume (3 ml) 2. Estrazione acidi nucleici 500 µl di campione (1/6 dell estratto) Lisi con buffer a base di guanidina Cattura AN su silice Lavaggi con tamponi contenenti etanolo Eluizione Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der NJ. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology 1990;28: NucliSens MiniMag Extraction System Comelli et al Resa Contaminazione Volume di campione estratto Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al sonda FAM-MGB

3 Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al NoV GI: da Silva et al Svraka et al NoV GII: Loisy et al Kageyama et al Primers/probes (Appendice C): - HAV: Costafreda et al NoV GI: da Silva et al Svraka et al NoV GII: Loisy et al Kageyama et al VPG ORF 1 ORF 2 ORF 3 AAA3 - Mengo: Costafreda et al FCV: Di Pasquale et al NV Proteine non strutturali (hel-prot-polimerasi) Proteina capsidica Proteina strutturale sonda FAM-TAMRA Condizioni di PCR (Appendice D): - One-step - Profilo termico - di AN - Ottimizzazione concentrazioni (RNA Ultrasense Invitrogen) Campione Controlli: - Controllo negativo - Controllo di inibizione (RNA) > efficienza di PCR [campione+rna vs. RNA] (curva stnd RNA) > recupero virus dalla matrice [campione vs. virus CP] (curva stnd virus CP) Aliquota dello stock virale utilizzato come CP per i campioni viene diluita 1:10 e sottoposta a trattamento termico per il rilascio dell'rna H2O H2O H2O H2O H2O

4 H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Mix H2O H2O Ct > efficienza PCR / inibitori H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O Mix Ct > efficienza 5 estrazione µl H2O 3.1 Controllo di inibizione / efficienza di PCR 3.2 / recupero campione + 1 µl vs. H 2 O + 1 µl campione vs. virus CP Ct=Ctcamp Ctstand Ct=Ctcamp Ctvirus CP E = 2 - Ct Limite accettabilità: E 50% R = 2 - Ct x d Limite accettabilità: R 1%

5 10µl 10µl 10µl 10 5 /µl = µl 10 5 /µl = g epatopancreas 2g epatopancreas 3ml sospensione (1:300) 3ml sospensione 3.3x10 2 /µl = µl 500µl 3.3x10 2 /µl = 1.6x10 5 (1/6) 100µl 5µl 100µl 5µl 100µl 1.6x10 3 /µl = 1.6x10 5 5µl 1.6x10 3 /µl = 8.3x µl 10 4 /µl = µl 10 4 /µl = 5x10 4 1:6 d=6 = 5x10 3 d=0.6 = 5x10 2 d=0.06 Esempio di piastra 2 H2O H2O H2O H2O Ct > efficienza PCR / inibitori H2O H2O Ct di riferimento Calcolo R 2 Mix H2O Ct > efficienza estrazione H2O Mix Esempio di piastra 3 H2O H2O SAGGI PRELIMINARI

6 Caratteristiche: - Virus coltivabile - Caratteristiche strutturali simili al target - Non presente naturalmente nella matrice - Assenza di interferenza nelle PCR Definizione della concentrazione d'uso n n n n n... 45,0 40,0 Riproducibilità Ct 35,0 30,0 Contaminazione 25,0 20, log10 diluizioni virus Controllo ad RNA Controllo ad RNA plasmide con inserto di sintesi promotore RNA polimerasi estrazione del plasmide con inserto sito di taglio enzimaico linearizzazione del plasmide trascrizione in vitro seq a RNA trasformazione E. coli coltura ALTERNATIVA: RNA estratto da coltura (HAV) o da sospensioni fecali (NoV) standard a RNA digestione DNA Controllo ad RNA Definizione della concentrazione d'uso n n n n n... GRAZIE 45,0 40,0 Riproducibilità Ct 35,0 30,0 25,0 Ct < cont. naturale Contaminazione 20, log10 diluizioni virus