Confronto di metodi di PCR Real Time per il rilevamento e la quantificazione di Zea Mays. Francesco Gatto
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1 Confronto di metodi di PCR Real Time per il rilevamento e la quantificazione di Zea Mays Francesco Gatto Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM IZS di Lazio e Toscana Roma 31 Ottobre 2007
2 Rilevamento di OGM P esone Int esone T
3 qpcr per OGM Regression curve C t 40,00 3,00 30,00 2,00 20,00 e y = -3,47x + 41,310 R 2 = 0,998 d c b a 1,00 1,0 2,00 2,0 3,00 3,0 4,00 4,0,00 Log(copy n) qpcr evento specifica qpcr specie specifica %
4 PCR Evento specifico PCR Evento specifica OGM I PCR Evento specifica DNA Pianta P sequenza codificante T DNA Pianta PCR Costrutto specifica DNA Pianta P sequenza codificante T DNA Pianta PCR Evento specifica OGM II PCR Evento specifica
5 Gene specie-specifico specificità della sequenza sequenza del target conservata all interno della specie, costante numero di copie nelle diverse varietà. adh, hmg, ssiib, zein, ivr lectin crua sah7 pld
6 CRL-ENGL Metodi validati REGOLAMENTO (CE) N. 1829/2003 REGOLAMENTO (CE) N. 1830/2003
7 Eventi ricercati in Italia Oggi Soia Soia RR Mais MON810 MON863 Bt11 T2 Bt176 NK603 GA21 TC 107 DAS 9122 (in corso di autorizzazione) StarLink BT10 Riso LL RICE 601 LL RICE 62 Bt 63 Domani Stato di avanzamento dei dossier di validazione del CRL: Metodi validati (2): 14 mais 1 barbabietola 2 cotone 2 riso colza 1 patata Totale 6 Metodi in corso di validazione (31): 14 mais 6 cotone 6 colza 3 soia 1 Brevibacterium 1 prodotto da lievito
8 Metodi GA21 MON863 NK603 ADH 1 adh1 F (GenBank X0400) BT11 T2 ADH 2 ADH 3 adh1 F (GenBank X0400) TC107 DAS 9122 HMG 4 HMG hmg a (GenBank AJ ) Scopo: Valutare la possibilità di adottare un unico protocollo per la quantificazione di Zea Mays.
9 Obiettivi Armonizzare le metodiche di analisi per l identificazione e la quantificazione specie-specifica di Zea mays tra i laboratori coinvolti nel controllo ufficiale Confronto di metodi validati dal CRL per l identificazione del mais al fine di verificare la loro equivalenza nell applicabilità alle diverse varietà di mais
10 DNA BT11 BT176 GA21 MON810 MON863 MON810 x MON863 NK603 CTAB Monitor Run DNA pool livello conc n copie/ul n copie/reaz. a 20, b, c 1, d 0, e 0, f 0, g 0,00 2 9
11 Protocollo di lavoro Stesse diluizioni del DNA pool gg met1 met2 met3 met4 met 1 POOL 2 diluiz. a b c d ng tot DNA ,2 1,6 copie genomic replicati e 0, f 0,10 36 g 0,02 9 1C=2,73 Royal Botanic Garden, Kew 3 Piastre
12 ANALISI DEI DATI Limite di rilevazione (LOD) Efficienza Linearità Precisione Esattezza Capacità di quantificazione
13 Limite di rilevazione Il limite di rilevazione (Limit of detection, LOD) è la minima quantità o concentrazione di analita che può essere rilevata in modo affidabile, ma non necessariamente quantificata, come dimostrato dalle prove di validazione inter o intra-laboratorio (Codex, 200, ISO/FDIS del 200). Ct g Retta di calibrazione 4,00 e 40,00 3,00 c a 30,00 f 2,00 d 20,00 b 1,00 y = -3,47x + 41,303 10,00 R 2 = 0,997,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00,00 Log(n.copie) St. Dev. RSDr% = 100 n. copie medio RSDr % 33% corsa ADH 1 ADH 2 ADH 3 HMG 4 HMG media
14 Parametri di regressione Retta di calibrazione 40,00 3,00 Ct 30,00 2,00 20,00 y = -3,47x + 41,310 R 2 = 0,998 1,00 1,0 2,00 2,0 3,00 3,0 4,00 4,0,00 Log(copy n) Slope/pendenza Indice di determinazione
15 Calcolo delle rette di calibrazione Dev. St. Metodo 1 Dev. St. Metodo 2 Dev. St. Metodo 3 1,200 1,200 1,200 Dev. St. 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 a b c d e f g Dev. St. 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 a b c d e f g Dev. St. 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 a b c d e f g Livello di concentrazione Livello di concentrazione Livello di concentrazione Dev. St. Metodo 4 Dev. St. Metodo 1,200 1,200 Dev. St. 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 a b c d e f g Dev. St. 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 a b c d e f g ,00 3,00 Retta di calibrazione Livello di concentrazione Livello di concentrazione Ct 30,00 2,00 20,00 y = -3,47x + 41,310 R 2 = 0,998 1,00 1,0 2,00 2,0 3,00 3,0 4,00 4,0,00 Log(copy n) ADH 1 ADH 2 ADH 3 HMG 4 HMG 1 Y = -3,47 X + 41,310 Y = -3,01 X + 40,08 Y = -3,31 X + 41,22 Y = -3,392 X + 39,709 Y = -3,337 X + 39,08 2 Y = -3,34 X + 40,370 Y = -3,86 X + 41,3 Y = -3,626 X + 40,022 Y = -3,499 X + 39,44 Y = -3,11 X + 39,009 3 Y = -3,87 X + 40,90 Y = -3,94 X + 40,081 Y = -3,876 X + 42,008 Y = -3,474 X + 39,134 Y = -3,0 X + 39,192 4 Y = -3,24 X + 41,044 Y = -3,617 X + 40,136 Y = -3,804 X + 41,394 Y = -3,13 X + 39,66 Y = -3,497 X + 39,163 Y = -3,794 X + 42,442 Y = -3,639 X + 40,341 Y = -3,803 X + 41,079 Y = -3,484 X + 39,160 Y = -3,614 X + 39,318 6 Y = -3,671 X + 41,68 Y = -3,689 X + 40,103 Y = -3,698 X + 40,48 Y = -3,463 X + 39,407 Y = -3,0 X + 38,789 7 Y = -3,62 X + 41,470 Y = -3,646 X + 40,439 Y = -3,770 X + 41,0 Y = -3,69 X + 39,343 Y = -3,16 X + 38,842
16 slope/efficienza Y=slope*x+intercept Efficienza di reazione pendenza -3,2-3,4-3,6-3,8-4,0 Efficienza % , metodo Metodo E = 10 1 slope 1
17 R 2 Goodness of fit (Indice di bontà di adattamento o Indice di determinazione) ENGL 200 R 2 0,98 R 2 ADH 1 ADH 2 ADH 3 HMG 4 HMG 1 0,998 0,998 0,998 0,998 0, ,996 0,990 0,997 0,999 0,99 3 0,997 1,000 0,996 0,997 0, ,997 0,998 0,996 0,997 0,997 0,99 0,998 0,99 0,998 0, ,996 0,999 0,997 0,996 0, ,99 0,998 0,996 0,996 0,998
18 Precisione & Esattezza Per precisione si intende il grado di accordo tra risultati analitici indipendenti ottenuti in condizioni definite (ISO 72-1, ISO 334-1). Il livello di precisione viene valutato come grado di imprecisione, cioè attraverso parametri di dispersione dei dati quali la deviazione standard semplice (σ) o relativa (RSD, CV%) dei replicati di misura condotti in condizioni di ripetibilità o di riproducibilità. Per esattezza si intende il grado di accordo tra il valore medio ottenuto da un ampia serie di risultati di prova ed il valore di riferimento accettato (ISO 334-1).
19 Ct = slope Log n. copie) + Intercetta n. copie 10 ( = 10 Ct Intercetta slope metodi , , , , , , , , , , , ,9 331, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,0 3208, , ,89 899, ,07 973, , ,09 988,4 9703, , , ,8 9186, , ,9 9977, ,1 986,88 97, , , ,4 944, , , , , , ,1 9740, , ,20 962, , , , , , , ,1 2376, ,7 232, , , , ,6 2424, ,86 210, , , , ,24 223,31 249,67 268, ,1 262, , , , ,70 228, ,2 2413, , ,2 2488,67 243,61 203, 1 64,19 61,4 48,90 608,13 91, ,72 702,71 628,32 623,24 669, ,48 72,62 08,84 62,17 78, ,03 4,89 499,3 9,77 83,70 79,10 629,40 8,80 601,92 612, ,70 602,12 60,74 669,96 97, ,84 69,81 26,01 64,9 83, ,86 139,38 13,29 136,02 137, ,7 118,33 132,13 13,01 124, ,99 139,66 13,48 138,76 137, ,33 139,03 136,02 131,69 13,0 127,7 129, 132,0 132,24 129, ,94 134,19 131,63 127,02 133, ,39 137,93 146,42 134,61 133,2
20 Precisione σ RSDr% = 100 µ RSDr% RSDr % METODO livello a 4,34,1 4,28 3,17 1,40 b 4,13 3,37 1,6 1,26 2,7 c,2 3,89 7,60,14 3,02 d,07 8,2 8,9 6,08 2,07 e 2,94,84 7,1 2,80 3,3 media 4,3,30,91 3,69 2, RSDr% a b c d e livello di concentrazione
21 Esattezza BIAS ASS BIAS = V V ASS BIAS% = 100 medio rif V rif n. copiemedio n. copieteorico BIAS% = 100 n. copie teorico BIAS% METODO valore riferimento ,00 10,1 6,01 6,0 7,6 9,9 9174,00 7,34 3,4,3,60 8, ,00 9,43,82 7,24,06,4 73,00 7,66,88 2,69,36 3,19 143,00 10,2 6,29 1,60 6,6 6,91 Media 9,09,1 4,9 6,0 6,7 BIAS % BIAS% n. copie
22 Capacità di quantificazione Copy n a b 3400 c Method Method Method Copy n. Copy n. 900 d 180 e Copy n Copy n Method Method
23 metodi , , , , , , , , , , , ,9 331, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,0 3208, , ,89 899, ,07 973, , ,09 988,4 9703, , , ,8 9186, , ,9 9977, ,1 986,88 97, , , ,4 944, , , , , , ,1 9740, , ,20 962, , , , , , , ,1 2376, ,7 232, , , , ,6 2424, ,86 210, , , , ,24 223,31 249,67 268, ,1 262, , , , ,70 228, ,2 2413, , ,2 2488,67 243,61 203, 1 64,19 61,4 48,90 608,13 91, ,72 702,71 628,32 623,24 669, ,48 72,62 08,84 62,17 78, ,03 4,89 499,3 9,77 83,70 79,10 629,40 8,80 601,92 612, ,70 602,12 60,74 669,96 97, ,84 69,81 26,01 64,9 83, ,86 139,38 13,29 136,02 137, ,7 118,33 132,13 13,01 124, ,99 139,66 13,48 138,76 137, ,33 139,03 136,02 131,69 13,0 127,7 129, 132,0 132,24 129, ,94 134,19 131,63 127,02 133, ,39 137,93 146,42 134,61 133,2 ANOVA (α=0,0) F cal = 2,14 < F tab =2,70 F cal = 2,8 > F tab =2,70 F cal = 0,72 < F tab =2,70 F cal = 2,39 < F tab =2,70 F cal = 3,40 > F tab =2,70
24 data slope efficienza intercetta R2 range (ng) n. punti 23/08/2007-3,06 92,8 38,96 1, ; 0,08 monitor run 06/09/2007-3,18 92,42 41,333 1, ; 0,08 monitor run 18/09/2007-3, ,24 38,04 0, ; 0,068 7 monitor run 26/09/2007-3,331 99,62 39,160 1, ; 0,068 7 monitor run 10/10/2007-3,428 9,76 39,169 0, ; 0,068 6 monitor run 26/06/2007-3,447 9,03 39,79 1, ; 1,09 qpcr DAS 13/06/2007-3,39 98,48 38,879 1, ; 1,09 qpcr DAS 02/04/2007-3,38 98,2 40,621 0,987 10; 0,6 qpcr TC107 16/03/2007-3,429 9,72 39,018 0,994 10; 0,6 qpcr TC107 12/01/2007-3,480 93,80 39,216 0,999 10; 0,6 qpcr TC107 media -3,400 97,044 39,399 0,997 dev.st. 0,111 4,634 0,934 0,004
25 Conclusioni Limite di rilevazione: tutti i metodi hanno mostrato un buon LOD (HMG 4+) Parametri di regressione: I metodi HMG (4 e ) hanno mostrato una efficienza di amplificazione maggiore. Precisione: molto al di sotto del limite prefissato Esattezza: molto al di sotto del limite prefissato ANOVA: HMG 4 ha evidenziato una capacità di quantificazione media comparabile con tutti metodi a tutti i livelli
26 Prospettive future Organizzazione di Ring test per la validazione e l accreditamento di metodi PCR real Time per la quantificazione di mais GM proposta: MON810 e NK603
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