Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento e la quantificazione del mais MON810 (MON )

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1 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE REGIONI LAZIO E TOSCANA (D.L.vo n. 270) SEDE CENTRALE - Via Appia Nuova, Roma/Capannelle Tel. (06) (centralino) - Fax (06) BIOTECNOLOGIE Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM Tel Fax crogm@izslt.it Report di validazione del metodo Real Time PCR per il rilevamento e la quantificazione del mais MON810 (MON ) Roma, 25/07/2008

2 Indice Introduzione... 3 Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzata... 4 Materiali...5 Materiali forniti ai laboratori...5 Materiali e strumenti forniti dai laboratori partecipanti...6 Disegno sperimentale... 7 Risultati... 8 Anomalie riportate...8 Efficienza e linearità... 9 Valutazione grafica dei dati dei laboratori Risultati della validazione Conclusioni Bibliografia ALLEGATI: ALLEGATO A: "Certificate of analysis ERM -AD413" ALLEGATO B: "Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL)" Pagina 2 di 14

3 Introduzione Il Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca di OGM (CROGM), in qualità di laboratorio nazionale di riferimento secondo il Regolamento (CE) 882/2004, ha organizzato uno studio collaborativo per la validazione di un metodo di quantificazione dell'evento di trasformazione mais MON810 rispetto all'ingrediente mais. Lo studio ha coinvolto 19 laboratori nazionali deputati al controllo ufficiale di OGM nel settore agro-alimentare ed è stato svolto nel periodo Maggio-Giugno Ai laboratori è stato fornito un protocollo dettagliato da seguire per l'esecuzione del metodo. Il protocollo utilizzato è derivato dall allegato alla norma ISO 21570:2005, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods [1] e la relativa validazione è stata valutata dal Community Reference Laboratory for GM Food and Feed (CRL-GMFF) il 10/03/2006 [2]. Allo scopo di migliorare la praticabilità del metodo, sono state introdotte piccole modifiche rispetto al metodo pubblicato sul sito web del CRL-GMFF: - entrambe le miscele di reazione, per il bersaglio endogeno e per quello transgenico, impiegano una master mix precostituita che consente una maggiore armonizzazione del sistema e una maggiore rapidità di esecuzione della prova; - come calibratore è stato utilizzato il plasmide ERM -AD413 prodotto e certificato dall'irmm e preparato dai partecipanti secondo le indicazioni fornite nel certificato allegato al materiale di riferimento [Allegato A]. L'impiego di un calibratore certificato in numero di copie ha il vantaggio di consentire il calcolo della percentuale di MON810 nei campioni incogniti come rapporto di numero di copie genomiche ottenute direttamente dalla curva di calibrazione; viceversa con i calibratori certificati in peso il numero di copie genomiche dei calibratori deve essere calcolato dividendo la quantità in peso del DNA estratto per il valore 1C medio pubblicato in letteratura per il genoma del mais [3]. Il rilevamento di MON810 avviene attraverso l'amplificazione di un frammento di 92 bp corrispondente alla regione di giunzione tra il costrutto GM e il DNA genomico. L amplicone comprende una regione del promotore 35S derivato dal CaMV e una porzione del genoma della pianta. Per la determinazione del contenuto totale di DNA di mais viene amplificata una sequenza di 79 bp, del gene della proteina high mobility group (hmg), caratteristica di Zea mays. Il contenuto relativo è ottenuto attraverso il rapporto tra il numero di copie di genoma aploide (1C) determinato per l evento MON810 (MON ) ed il numero totale di copie genomiche aploidi di DNA di mais. Lo studio collaborativo e la valutazione dei relativi risultati sono stati effettuati secondo le seguenti linee guida internazionali: - ISO 5725:1994 [4]; - Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version [Allegato B]. Pagina 3 di 14

4 Elenco dei partecipanti e strumentazione utilizzata Tabella 1: Partecipanti e strumentazione utilizzata APPA Bolzano ARPA Emilia Romagna ARPA Friuli Venezia Giulia Dipartimento Provinciale di Pordenone ARPA Friuli Venezia Giulia Dipartimento di Trieste ARPA Piemonte ARPA Valle d'aosta ARPA Veneto ASL 10 - Firenze ASL della Provincia di Cremona ICycler iq (BioRad) icycler (BioRad) icycler (BioRad) ICycler (BioRad) (BioRad) ICycler IQ5 (BioRad) ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) ICycler (BioRad) Gene Amp 5700 SDS (Applied Biosystems) ENSE ABI SDS 7000 IZS Abruzzo e Molise IZS Lazio e Toscana ABI Prism 7900HT Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems) ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) IZS Lombardia e Emilia Romagna IZS Mezzogiorno IZS Piemonte Liguria e Valle d'aosta IZS Sardegna IZS Sicilia IZS Umbria e Marche IZS Venezie ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems) ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) *Uno dei laboratori ha utilizzato il termoblocco a 384 pozzetti. Pagina 4 di 14

5 Materiali Materiali forniti ai laboratori Standard: per la calibrazione dello strumento sono stati forniti una aliquota del volume di 180 µl del plasmide ERM -AD413 e una aliquota di 6 ml del rispettivo Buffer di diluizione (TE). Campioni incogniti di DNA: 20 campioni incogniti di DNA marcati da C1 a C20 alla concentrazione di 20 ng/µl (80 µl). I campioni distribuiti sono stati estratti da: - farine di mais certificate per il contenuto relativo in peso (w/w) di mais MON810 (IRMM), il livello MON g/kg (1%) è certificato anche per il contenuto in un numero di copie di genoma aploide (g.c./g.c.); - un mangime misto non contenente OGM. Tabella 2: Materiali utilizzati per la preparazione dei campioni C1-C20 MON810 MON810 MON810 MON810 Contenuto e codice dei campioni 1,00 ± 0,26 g/kg ERM -BF413b 5,0 ± 0,4 g/kg ERM -BF413c 10,0 ± 0,5 g/kg 0,57 ± 0,17 % g.c./g.c. ERM -BF413d 50,0 ± 1,1 g/kg ERM -BF413f Etichetta campioni distribuiti C5, C9, C11, C16 C1, C4, C14, C18 C2, C8, C13, C19 C7, C10, C15, C20 non OGM Mangime misto C3, C6, C12, C17 Reagenti - 2X TaqMan PCR Universal Master Mix [5 ml] - HMG For (MaiJ-F2) primer (20 pmol/μl) [80 µl] - HMG Rev (mhmg-rev) primer (20 pmol/μl) [80 µl] - HMG (Mhmg) Probe (5 pmol/μl) [200 µl] - MON For (Mail-F1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl] - MON Rev (Mail-R1) Primer (20 pmol/μl) [80 µl] - MON (Mail-S2) Probe (5 pmol/μl) [200 µl] - Acqua grado reagente sterile [10 ml] Tabella 3: Sequenza Primer e Probe utilizzati Nome primer Sequenza 5-3 HMG For TTg gac TAg AAA TCT CgT gct ga HMG Rev gct ACA TAg gga gcc TTg TCC T HMG Probe FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gcg TA-TAMRA MON For TCg AAg gac gaa gga CTC TAA CgT MON Rev gcc ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT MON Probe FAM-AAC ATC CTT TgC CAT TgC CCA gc-tamra Pagina 5 di 14

6 Materiali e strumenti forniti dai laboratori partecipanti - MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plates - Optical caps or Optical adhesion covers - Micropipette - Supporti per provette - Provette tipo Eppendorf DNAse free da 1,5 ml - Provette tipo Eppendorf DNAse free da 2 ml - Strumento per Real Time PCR e software di analisi - Microcentrifuga - Vortexer Pagina 6 di 14

7 Disegno sperimentale Ciascun laboratorio ha provveduto alla preparazione di due piastre di PCR (piastra A e piastra B) in ciascuna delle quali sono state allestite due reazioni, una per il sistema evento specifico MON810 e l'altra per il sistema endogeno HMG. Ogni partecipante ha provveduto all'allestimento delle diluizioni del plasmide ERM - AD413 secondo le indicazioni del protocollo di validazione, derivate dal certificato di analisi [Allegato A] e riportate di seguito nella tabella 4. Sono stati caricati i livelli di concentrazione del plasmide come indicato dal certificato e i campioni da C1 a C10 e da C11 a C20 rispettivamente per le piastre A e B. Tutti i campioni sono stati analizzati in tre repliche di PCR per il sistema MON810 e HMG. Il calcolo del contenuto relativo è stato eseguito utilizzando un foglio di calcolo excel fornito dal Centro di Referenza. Tabella 4: Preparazione dei calibratori E T Conc. Iniziale Cp/µl Conc. Finale Cp/µl Fattore di diluizione Vol DNA µl Vol Buffer µl S1 2 x x S2 E 5 x S3 E x S4 T 2 x S5 E T S6 E S7 E T S8 T S9 T *E= Endogeno HMG; T= Transgenico MON810 Pagina 7 di 14

8 Risultati Tabella 5: Risultati 0,10% 0,50% 1,00% 5,00% mangime Lab. n. C05 C09 C11 C16 C01 C04 C14 C18 C02 C08 C13 C19 C07 C10 C15 C20 C03 C06 C12 C17 1 0,04 0,04 0,08 0,05 0,24 0,19 0,28 0,26 0,51 0,44 0,61 0,56 2,86 2,80 3,24 2,87 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,06 0,05 0,10 0,06 0,33 0,33 0,37 0,33 0,59 0,57 0,75 0,61 2,63 2,26 3,42 2,73 0,00 0,00 0,00 0,00 3 0,16 0,15 0,10 0,13 0,45 0,40 0,40 0,37 0,83 0,77 0,66 0,95 3,20 4,48 4,06 4,37 0,00 0,00 0,00 0,00 4 0,09 0,06 0,07 0,08 0,39 0,37 0,32 0,32 0,78 0,51 0,66 0,82 3,57 2,45 3,32 3,96 0,00 0,00 0,00 0,00 5 0,10 0,12 0,10 0,08 0,43 0,41 0,39 0,40 0,87 0,80 0,94 0,77 4,23 4,13 4,09 3,94 0,00 0,00 0,00 0,00 6 0,10 0,12 0,09 0,10 0,35 0,36 0,36 0,40 0,74 0,66 0,74 0,85 2,64 3,57 3,21 3,76 0,00 0,00 0,00 0,00 7 0,12 0,12 0,10 0,10 0,33 0,42 0,42 0,41 0,75 0,72 0,70 0,90 3,33 3,72 3,86 3,66 0,00 0,00 0,00 0,00 8 0,10 0,08 0,09 0,08 0,34 0,35 0,35 0,35 0,66 0,65 0,70 0,67 3,40 3,25 3,20 3,17 0,00 0,00 0,00 0,00 9 0,05 0,05 0,07 0,05 0,24 0,27 0,34 0,24 0,61 0,50 0,85 0,54 3,62 2,82 3,38 2,98 0,00 0,00 0,00 0, ,05 0,04 0,05 0,04 0,23 0,16 0,22 0,20 0,35 0,36 0,38 0,32 1,45 1,65 1,65 1,57 0,00 0,00 0,00 0, ,06 0,07 0,06 0,06 0,33 0,27 0,24 0,27 0,53 0,54 0,57 0,55 2,45 2,63 2,55 2,75 0,00 0,00 0,00 0, ,06 0,06 0,07 0,06 0,26 0,25 0,23 0,24 0,56 0,48 0,57 0,47 2,72 2,79 2,67 2,70 0,00 0,00 0,00 0, ,05 0,04 0,07 0,07 0,29 0,21 0,30 0,25 0,52 0,44 0,94 0,47 3,19 2,79 4,27 3,66 0,00 0,00 0,00 0, ,06 0,04 0,03 0,03 0,25 0,29 0,19 0,17 0,50 0,45 0,45 0,28 3,44 2,53 2,01 2,15 0,00 0,00 0,00 0, ,07 0,10 0,10 0,07 0,33 0,31 0,29 0,32 0,69 0,62 0,63 0,69 3,32 3,35 3,00 3,27 0,00 0,00 0,00 0, ,07 0,07 0,06 0,07 0,33 0,39 0,37 0,47 0,61 0,92 0,67 1,00 3,97 4,35 4,04 3,62 0,00 0,00 0,00 0, ,07 0,08 0,07 0,04 0,21 0,27 0,20 0,36 0,54 0,57 0,48 0,47 3,76 4,78 2,77 3,71 0,56* 0,00 0,00 0, ,09 0,08 0,06 0,07 0,41 0,38 0,27 0,29 0,80 0,75 0,54 0,59 3,06 3,11 2,74 2,96 0,00 0,00 0,00 0, ,00 0,00 0,07 0,07 0,32 0,31 0,43 0,41 0,64 0,64 0,66 0,63 2,66 2,51 3,89 2,52 0,00 0,00 0,00 0,00 * dato non considerato nelle analisi successive Anomalie riportate - Il laboratorio 1 ha eliminato il punto di calibrazione S9 per il sistema di quantificazione MON810 per la piastra A; - Il laboratorio 7 ha eseguito le prove con un volume di reazione pari a 20 µl invece di 25 µl mantenendo le medesime concentrazioni dei reagenti; - Il laboratorio 14 ha eseguito l'export dei dati con una sola cifra decimale; - Il laboratorio 19 ha eliminato un replicato di PCR del punto di calibrazione S9 per il sistema di quantificazione MON810 in entrambe le piastre (A e B) e ha eliminato il punto S5 della calibrazione del sistema HMG in entrambe le piastre (A e B). Pagina 8 di 14

9 Efficienza e linearità Tabella 6: Valori di slope, efficienza e R 2 per i sistemi MON810 e HMG MON810 Slope Efficienza (%) R 2 Lab. n. A B A B A B 1-3,432-3,709 95,6 86,0 0,996 0, ,546-3,592 91,4 89,8 0,996 0, ,665-3,562 87,4 90,9 0,993 0, ,636-3,586 88,4 90,0 0,977 0, ,766-3,596 84,3 89,7 0,999 0, ,591-3,618 89,9 89,0 0,983 0, ,544-3,633 91,5 88,5 0,997 0, ,51-3,418 92,7 96,1 0,999 0, ,525-3,667 92,2 87,4 0,997 0, ,497-3,527 93,2 92,1 0,990 0, ,634-3,57 88,4 90,6 0,988 0, ,489-3,526 93,5 92,1 0,997 0, ,351-3,391 98,8 97,2 0,993 0, ,544-3,248 91,5 103,2 0,998 0, ,558-3,593 91,0 89,8 0,998 0, ,409-3,403 96,5 96,7 0,993 0, ,644-3,52 88,1 92,3 0,983 0, ,655-3,385 87,8 97,4 0,990 0, ,695-3,851 86,5 81,8 0,995 0,995 Media Media Media -3,555 91,3 0,993 HMG Slope Efficienza (%) R 2 Lab. n. A B A B A B 1-3,375-3,413 97,8 96,3 0,999 0, ,494-3,644 93,3 88,1 0,992 0, ,408-3,407 96,5 96,6 0,999 0, ,314-3, ,3 102,3 0,993 0, ,77-3,648 84,2 88,0 0,999 0, ,314-3, ,3 97,4 0,999 0, ,485-3,479 93,6 93,8 0,999 1, ,444-3,482 95,1 93,7 0,999 0, ,43-3,334 95,7 99,5 0,996 0, ,444-3,365 95,1 98,2 0,997 0, ,464-3,471 94,4 94,1 0,999 0, ,421-3,316 96,0 100,2 0,999 0, ,373-3,326 97,9 99,8 1,000 0, ,465-3,356 94,4 98,6 0,995 0, ,427-3,451 95,8 94,9 0,999 1, ,389-3,269 97,3 102,3 0,996 0, ,604-3,598 89,4 89,6 0,996 0, ,394-3,382 97,1 97,6 0,998 0, ,429-3,476 95,7 93,9 0,996 0,996 Media Media Media -3,435 95,7 0,997 Per tutti i metodi è possibile osservare una buona corrispondenza tra il modello di regressione calcolato e la distribuzione dei dati. In particolare il valore di R 2 è sempre maggiore o uguale al valore limite di accettabilità fissato a 0,98 [Allegato B]. E' quindi possibile osservare una buona linearità di risposta nell intervallo di numero di copie: - HMG: [1000; 5x10 5 ]; - MON810: [25; 5x10 4 ]; Per quanto riguarda l efficienza di reazione ricordiamo che il valore del coefficiente angolare (slope) della retta di calibrazione è direttamente correlato con l efficienza in particolare: E (%) = 10 1 slope Il valore di slope medio, e quindi l'efficienza di reazione, è considerato accettabile nel caso in cui sia compreso nell'intervallo [-3,1;-3,6] [Allegato B] corrispondente a valori di efficienza compresi tra 110% e 87%. I valori di slope per i sistemi di quantificazione di MON810 e HMG sono rispettivamente pari a -3,555 (efficienza: 91,3%) e -3,435 (efficienza: 95,7%) e sono quindi in accordo con i limiti di accettabilità. Pagina 9 di 14

10 Valutazione grafica dei dati dei laboratori Le statistiche h e k di Mandel, oltre che valutare la variabilità del metodo di misurazione, sono anche utili ai fini dell'individuazione di eventuali anomalie attribuibili a singoli laboratori [4]. In particolare la statistica h è un test per la verifica della coerenza interlaboratorio (between-laboratory consistency test statistic) mentre k verifica la coerenza dei dati ottenuti dal laboratorio (within-laboratory consistency test statistic) [4 ]. h 3,000 2,000 1,000 h 0,000-1,000-2,000-3, Laboratori Fig. 1: Rappresentazione della statistica h. Le linee tratteggiate rappresentano i livelli di significatività del 1% (19 laboratori: ± 2,37) e del 5% (19 laboratori: ± 1,88) k 3,000 2,500 2,000 k 1,500 1,000 0,500 0, Laboratori Fig. 2: Rappresentazione della statistica k. Le linee tratteggiate rappresentano i livelli di significatività del 1% (19 laboratori e 4 campioni: 1,89) e del 5% (19 laboratori e 4 campioni: 1,59) Pagina 10 di 14

11 Il grafico dei valori di h mostra che i laboratori 3 e 10 presentano valori rispettivamente più alti e più bassi rispetto a quelli ottenuti dagli altri laboratori. Detti risultati comunque superano i valori di accettabilità con un livello di significatività dell'1% solo su uno dei livelli di concentrazione, pertanto si è ritenuto di non escludere nessuno dei laboratori. Nel grafico dei valori k i laboratori 13 e 19 presentano una variabilità ampia tra i risultati delle prove replicate, ma solo su un livello di concentrazione (per il laboratorio 13 il livello 1%, per il laboratorio 19 il livello 0,1%), pertanto non è stato ritenuto opportuno escludere i due laboratori complessivamente. Dall'osservazione dei dati grezzi non sono state osservate anomalie particolari per il laboratorio 13, mentre per il laboratorio 19 si è osservata la mancata rilevazione di segnale di amplificazione per due dei quattro replicati del livello 0,1% in una delle due piastre. Dall'analisi dei dati grezzi del laboratorio 19 sono stati osservati valori di Ct assoluti, per tutti i campioni e standard, più alti rispetto a quelli forniti dagli altri partecipanti. Nei grafici delle figure 3 e 4 sono riportati i valori di Ct medi per gli estremi delle curve di calibrazione per ciascun laboratorio. Da questi grafici è possibile osservare che il laboratorio 19 presenta valori di Ct mediamente molto più alti. MON810 Ct S4 - S9 S4 piastra A S4 piastra B S9 piastra A S9 piastra B 45,00 40,00 35,00 Ct 30,00 25,00 20, Laboratorio Fig. 3: Valori di Ct del sistema MON810 per le concentrazioni S4 (5x10 4 copie) e S9 (25 copie) della curva di calibrazione Pagina 11 di 14

12 HMG Ct S2 - S7 S2 piastra A S2 piastra B S7 piastra A S7 piastra B 40,00 35,00 30,00 Ct 25,00 20,00 15, Laboratori Fig. 4: Valori di Ct del sistema HMG per le concentrazioni S2 (5x10 5 copie) e S9 (10 3 copie) della curva di calibrazione Lo "spostamento" della curva di calibrazione e dei campioni a Ct più alti potrebbe aver determinato un aumento del LOD per il laboratorio in oggetto e quindi una maggiore variabilità sui bassi livelli di concentrazione. In effetti il test di Cochran effettuato sul livello 0,1% ha evidenziato i dati forniti dal laboratorio 19 come outlier, richiedendone quindi l'eliminazione (vedi tabella 7). Complessivamente i laboratori hanno fornito dati coerenti sia a livello intra che interlaboratorio e pertanto nessuno di essi è stato escluso dalle analisi successive. Pagina 12 di 14

13 Risultati della validazione Tabella 7: Risultati validazione Farina mista non GM Campioni 5,00% w/w 1 0,10% w/w 1 0,50% w/w 1 0,57% 1,00% w/w 1 g.c./g.c. 2 Numero laboratori Numero di campioni per laboratorio Numero di outliers / 1 / / / Motivo dell'esclusione / 1 C 3 / / / Valore medio 0,00 0,08 0,32 0,63 3,17 Deviazione standard di ripetibilità / 0,01 0,04 0,11 0,43 Dev. standard reltiva di ripetibilità (RSD r %) Limite accettabilità: 25% / Deviazione standard di riproducibilità / 0,03 0,08 0,16 0,72 Dev. standard relativa di riproducibilità, RSD R % Limite accettabilità: liv. <0,2% 50%; liv. 0,2% 35% / Bias (Valore assoluto) / / / 0,06 / Bias % Limite accettabilità: ±25% / / / 11 / note: 1 w/w: weight/weight; 2 g.c./g.c.: genome copy/genome copy; 3 C: Cochran test Sulla matrice non-gm tutti i laboratori hanno fornito il valore atteso. La deviazione standard relativa di ripetibilità mostra il valore maggiore pari a 19% per il livello 0,10% w/w al di sotto del limite del 25% indicato nel documento ENGL [Allegato B]. La deviazione standard relativa di riproducibilità, che descrive la variabilità interlaboratorio del metodo, risulta pari al 37% per il livello 0,10%, in accordo con il limite del 50% stabilito per livelli di concentrazione di OGM < 0,20%, ed in accordo con il limite del 35% per gli altri livelli di concentrazione [Allegato B]. L'esattezza è stata valutata sul livello 0,57% g.c./g.c. in quanto esso rappresenta l'unico campione distribuito certificato per il contenuto in numero di copie di MON810; il BIAS è risultato pari all'11%, in accordo con il livello di accettabilità di ±25% [Allegato B]. Conclusioni Complessivamente le performance del metodo di analisi riportate risultano essere in accordo con i limiti stabiliti dal documento ENGL "Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing". Pertanto il metodo risulta validato e adatto alla rilevazione e quantificazione di mais MON810. La valutazione del BIAS del metodo è stata effettuata sull'unico livello certificato in numero di copie di DNA aploide e non su tutto il range di quantificazione. La disponibilità in futuro di un maggior numero di calibratori certificati per il contenuto in numero di copie genomiche aploidi consentirà di valutare l'esattezza su diversi livelli di concentrazione. Pagina 13 di 14

14 Bibliografia 1. ISO 21570:2005, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods 2. CRL assessment on the validation of an event specific method for the relative quantitation of maize line MON810 DNA using real-time PCR as carried out by Federal Institute for Risk Assessment (BfR); (2006); 3. Certificate of analysis ERM -AD413; 4. Arumuganathan, K., Earle, E.D. (1991). Nuclear content of some important plant species. Plant Mol Biol Reporter 9, UNI ISO 5725 "Accuratezza (esattezza e precisione) dei risultati e dei metodi di misurazione." Norma italiana, Agosto Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories (ENGL). Version ; Redatto da: Francesco Gatto, Annalisa Paternò, Michela Boncagni Verificato da: Ilaria Maria Ciabatti e Ugo Marchesi Approvato da: Demetrio Amaddeo Pagina 14 di 14