Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare

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1 Quantificazione di legionella pneumophila mediante metodo biomolecolare Laboratorio di Epidemiologia Genetica e Genomica di Sanità Pubblica Istituto di Igiene LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 1

2 Unità Genomiche ed Unità Formanti Colonie Il metodo colturale (microbiologico) determina i batteri VIVI misurati come unità formanti colonia UFC Il metodo biomolecolare determina i batteri VIVI e i batteri MORTI misurati come unità genomiche UG in assenza di batteri morti UFC=UG Il Metodo biomolecolare per la ricerca di legionella pneumophila NON è riconosciuto dalle linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi (G. U. Repubblica Italiana, serie generale n. 103 del 05 maggio 2000 ) ma viene utilizzato nel nostro policlinico esclusivamente a fini PREVENTIVI. Dal prossimo anno il metodo biomolecolare comparirà sulle linee guida e sarà approvato solo a scopo di SCREENING. LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 2

3 Da Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi (G. U. Repubblica Italiana, serie generale n. 103 del 05 maggio 2000 ) Nessun intervento: [leg] < 10 2 UFC/L e assenza di casi di legionellosi Blocco della sorgente e aumentata sorveglianza: 10 3 UFC/L < [leg] < 10 4 UFC/L e assenza di casi di legionellosi Bonifica: 10 3 UFC/L< [leg] < 10 4 UFC/L e 1 o più casi di legionellosi oppure [leg] > 10 4 UFC/L LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 3

4 Acqua filtrata Lisi dei batteri, estrazione del DNA e purificazione Rilevazione e/o quantificazione con PCR o real-time PCR LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 4

5 Kit Biorad con certificazione AFNOR Aquadien TM kit per estrazione DNA da acqua iq-check Quanti L. pneumophila kit per quantificazione di L. pneumophila mediante Real Time PCR LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 5

6 FILTRAZIONE Filtrare l acqua del campione LISI BATTERICA Tagliare il filtro in 2 parti Piegarlo attentamente Mettere le 2 parti del filtro In un tubo da 2 ml Vortexare 10 min Vortexare Incubare a 95 C/15 min Buffer di lisi LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 6

7 PURIFICAZIONE ELUIZIONE Etanolo Trasferire Su una colonnina Centrifugare o Aspirare tramite vuoto Metter la colonna in un nuovo tubo da centrifuga Centrifugare 12,000rpm/5 min Centrifugare 12,000rpm/5 min Aggiungere Tampone di eluizione Incubare 5 min a RT Soluzione di 100 µl di DNA pronta per la PCR LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 7

8 Real Time PCR Nella real-time PCR, oltre alla classica coppia di primers specifici (ad es. per il microrganismo da cercare), viene aggiunto alla miscela di reazione di PCR una sonda fluorescente, che legandosi ad un segmento di DNA compreso tra le estremità amplificate dai primers, permette di visualizzare il prodotto di amplificazione in tempo reale da qui real time Risultato Qualitativo e Quantitativo LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 8

9 Fluorogenic 5 Nuclease Assay Inizio della polimerizzazione distacco della sonda Fine della polimerizzazione distruzione della sonda LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 9

10 Curva di amplificazione 96 Repliche di identiche reazioni di PCR (identica( con DNA iniziale) generano quantità finali di prodotto di PCR molto diverse così come diverse quantità di DNA iniziali possono mostrare identici valori a plateau (ma saranno diversi però tali valori nella fase esponenziale!!!) LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 10

11 Curva di amplificazione Ct: è il ciclo di amplificazione in cui la fluorescenza del campione aumenta significativamente rispetto a quella della Threshold Threshold: linea soglia scelta dall operatore (o automaticamente dallo strumento) in maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale. Baseline region: indica il valore al di sopra del quale inizia l accumulo di un amplificato. fluorescenza relativa (Rn) numero di cicli LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI

12 Quantificazione e retta standard Si genera plottando i valori di Ct con il loro CI al 95% versus log copie acido nucleico LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 12

13 RISULTATI Il risultato biomolecolare viene espresso come Unità Genomiche di legionella pneumophila per litro di Acqua (UG/L). Invio di un fax di allerta alla Direzione Sanitaria In genere se [leg] > 10 3 UG/L si predispone il blocco preventivo della sorgente idrica, ma questo è a discrezione del Direttore Sanitario. LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA PROFESSIONALIZZANTI 13