AQUADIEN Kit Codice #: test

Transcript

1 AQUADIEN Kit Codice #: test Manuale d istruzioni KIT PER L ESTRAZIONE E LA PURIFICAZIONE DI DNA A PARTIRE DA BATTERI CONTENUTI NEI CAMPIONI DI ACQUA

2 SOMMARIO I. INTRODUZIONE II. III. IV. COMPOSIZIONE DEL KIT VALIDITÀ E CONSERVAZIONE ATTREZZATURE E MATERIALI NECESSARI (NON FORNITI NEL KIT) V. PRECAUZIONI VI. CAMPIONATURE E TRASPORTO DEI CAMPIONI VII. PROTOCOLLO PER LA FILTRAZIONE DELL ACQUA E L ESTRAZIONE DI DNA VIII. CALCOLO DELL FRAZIONE DI CAMPIONE ANALIZZATO APPENDICE: SCHEMA DI PIEGATURA DELLA MEMBRANA 2

3 I. INTRODUZIONE Numerosi sono i batteri presenti nell ambiente acquatico. Molti sono inoffensivi, ma alcuni di essi possono essere causa di infezioni o di malattie per l'uomo, come la Legionella o Pseudomonas aeruginosa. Altri batteri possono servire da indicatori di inquinamento dell acqua, come nel caso dell E. coli. Il controllo della presenza di questi batteri nei sistemi di distribuzione dell acqua, nelle piscine, negli hammam o nelle acque delle bevande o di processi industriali è il solo mezzo di prevenzione di patologie o infezioni. La ricerca e l enumerazione di questi batteri è obbligatorio o fortemente raccomandato nella maggior parte dei paesi sviluppati. I metodi di rilevamento convenzionali tramite microbiologia classica presentano diversi inconvenienti, in particolare una bassa sensibilità e lunghi periodi di coltura. La PCR (Reazione di Polimerizzazione a Catena) in real-time consente di ottenere risultati in 24 ore ed è pertanto la tecnica più frequentemente utilizzata per la ricerca di patogeni o di indicatori di inquinamento delle acque. Con questo metodo, sequenze di DNA specifiche del genere o della specie del batterio d interesse vengono amplificate e rilevate in real-time, grazie a sonde fluorescenti. Il kit AQUADIEN consente un estrazione ottimale del DNA dei batteri presenti nei campioni d acqua per un rilevamento tramite PCR in real-time. Il principio è basato su una lisi per shock termico in terreno alcalino, seguito da una purificazione del DNA tramite ultrafiltrazione. Il kit ha mostrato risultati per l analisi eccellente di Legionella e Pseudomonas aeruginosa tramite PCR in real-time. II. COMPOSIZIONE DEL KIT Componenti del Kit Quantità per Kit R1 Soluzione di lisi 2 x 100 ml R2 Soluzione di eluzione 1 x 25 ml Cryotubes 4.5 ml 2 x 50 unità Colonne di purificazione 1 x 96 unità Flaconi di recupero 2 x 192 unità Istruzioni per l uso 1 Il kit AQUADIEN consente di effettuare 96 estrazioni di DNA a partire da campioni d acqua. III. VALIDITÀ E CONSERVAZIONE Sin dalla ricezione, il kit deve essere conservato fra +2 C e +8 C. Ogni reagente conservato fra 2 C e +8 C può essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sulla fiala. I reagenti non devono essere congelati. IV. ATTREZZATURE E MATERIALI NECSSARI PER LA FILTRAZIONE E L ESTRAZIONE DI DNA (NON FORNITI NEL KIT) 1. Attrezzature Filtrazione del campione d acqua Apparecchio di filtrazione (montato o su pompa a vuoto o su beuta caudata) in un ambiente sterile, ad esempio in prossimità di un becco Bunsen acceso. Area di sicurezza microbiologica classe 2 Estrazione di DNA Bagnomaria liquido a 95 C ± 5 C, preferibilmente con coperchio. Vortex Centrifuga con rotore angolare per provette da ml con una capacità di rotazione di 6000 x g e preferibilmente refrigerata Opzionale: centrifuga refrigerata con un rotore per provette da 1,5-2 ml con una capacità di rotazione di x g Agitatore magnetico 3

4 2. Materiale di laboratorio Filtrazione Membrana in policarbonato di porosità nominale 0.45 µm. Se si utilizza un altra membrana, quest ultima deve essere oggetto di una validazione preliminare nel laboratorio. Non utilizzare membrane contenenti cellulosa. L utilizzo di membrane in PVDF è sconsigliato. Imbuti sterili monouso da 250 ml Pinze metalliche in inox a punte tonde, sterili Estrazione di DNA Micropipette da 10 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl e 1000 μl Punte filtro sterili, adattabili sulle micropipette 10 μl, 20 μl, 100 μl, 200 μl et 1000 μl Altri materiali Guanti senza polvere Maschera respiratoria monouso Acqua (esente da DNA di Legionella) Candeggina 5% Alcol 70% 3. Reagenti Opzionale: Reagente W2 per l estrazione di DNA dei campioni ostruenti (Rif. Bio-Rad: ) V. PRECAUZIONI Questo test deve essere effettuato da personale qualificato. I campioni d acqua devono essere manipolate ed eliminate come materiali potenzialmente infettivi. La qualità dei risultati dipende dal rispetto scrupoloso delle buone pratiche di laboratorio. Il materiale (pipette, provette, ecc.) non deve circolare da una postazione di lavoro ad un altra. È indispensabile utilizzare almeno un controllo negativo di estrazione ad ogni serie di estrazioni, preferibilmente a fine serie. Non utilizzare i reagenti al di là della data di scadenza. Miscelare su Vortex i reagenti del kit prima del loro utilizzo per lavorare con soluzioni omogenee. Verificare l esattezza e la precisione delle pipette, nonché il buon funzionamento degli strumenti. Cambiare i guanti regolarmente e al minimo sospetto che possano essere stati contaminati. Pulire regolarmente le superfici di lavoro con candeggina 5% e risciacquare con acqua (esente da DNA Legionella) e alcol 70%. Decontaminare i piccoli strumenti da laboratorio necessari per la filtrazione (pinze metalliche, ecc.) con alcol dopo ogni filtrazione, poi sterilizzarli con l ausilio del Bunsen. Verificare che le pinze siano ben raffreddate prima dell uso. VI. CAMPIONATURE E TRASPORTO DEI CAMPIONI I campioni d acqua devono essere raccolti in base alle norme generali per la ricerca e l enumerazione dei batteri tramite microbiologia classica (NF T e ISO ). I campioni devono essere prelevati in recipienti sterili in vetro, polietilene o altri flaconi. Se il campione d acqua contiene o si presume che contenga un biocida ossidante, aggiungere in quantità sufficiente un agente neutralizzante appropriato. I campioni devono essere consegnati al laboratorio il più rapidamente possibile, preferibilmente entro 24 ore, in ogni caso senza superare 48 ore dal prelievo del campione. 4

5 Se i campioni vengono trasportati e analizzati entro 24 ore, allora il trasporto e lo stoccaggio possono essere effettuati a temperatura ambiente. Se i campioni vengono trasportati e analizzati entro 48 ore, allora il trasporto e lo stoccaggio devono essere effettuati a +2 C/+8 C. Nota: Attendere 48 ore dopo un trattamento biocida prima di prelevare un campione d acqua al fine di effettuare un analisi PCR in real-time. VII. PROTOCOLLO PER LA FILTRAZIONE DELL ACQUA E L ESTRAZIONE DI DNA Si raccomanda vivamente di leggere l intero protocollo prima di iniziare il test. Rispettare scrupolosamente il protocollo proposto. 1. Operazioni preliminari Accendere il bagnomaria e regolarlo a 95 C ± 5 C. Verificare l altezza del livello d acqua nel bagnomaria affinché le provette da 4.5 ml siano ben immerse. Preparare il numero di Cryotube corrispondente al numero di campioni sottoposti ad estrazione di DNA. Distribuire 2 ml di R1 in ciascun Cryotube. Nota: Durante la pipettatura, verificare che R1 sia costantemente sotto agitazione magnetica in modo che il reagente di lisi sia perfettamente omogeneo. Utilizzare un puntale sufficientemente largo (es. utilizzare una pipetta da 200 µl µl con il puntale corrispondente). Preparare il numero di colonne di purificazione necessario, posizionando ciascuna colonna con la parte blu in alto, in un flacone di recupero. 2. Filtrazione dei campioni d acqua 1. Filtrare 100 ml di acqua esente da DNA di Legionella sulla rampa di filtrazione e bruciare la rampa con alcol per decontaminarla. Verificare che la parte che sostiene il filtro sia asciutta e fredda prima di procedere alla filtrazione del campione. Ripetere questa operazione dopo la filtrazione di ciascun campione per evitare ogni contaminazione batterica o da parte del DNA di Legionella fra le filtrazioni. 2. Posizionare la membrana filtrante sull apparecchio di filtrazione. Posizionare un imbuto sterile su ciascun filtro. 3. Filtrare da 100 ml a 1 L di campione d acqua sulla membrana filtrante. 3. Estrazione e purificazione di DNA A partire da questa fase, lavorare con guanti senza polvere. 1. Piegare delicatamente la membrana in 2, tre volte di seguito per ottenere un cono (cfr. schema di piegatura della membrana in Appendice). 2. Prendere la membrana con le pinze e introdurla in un Cryotube contenente 2 ml di R1. La punta del cono formato dalla membrana dopo la piegatura deve essere diretta verso l alto del Cryotube (cfr. schema di piegatura della membrana in Appendice). 3. Miscelare su Vortex per 20 sec. Nota: Verificare che la membrana resti ben immerso nella soluzione R1. 4. Incubare per 15 min in un bagnomaria a 95 C ± 5 C. Coprire con coperchio se il bagnomaria ne è dotato. 5. Miscelare su Vortex per 20 sec. 6. Ritirare la membrana mediante, con un cono sterile da 1 ml e tamponarla lungo la parete del Cryotube per recuperare tutto il lisato. Gettare via la membrana. In questa fase, il lisato può essere conservato a +2 C/+8 C per ore. 5

6 7. Lasciare che i Crytotube si raffreddino a temperatura ambiente per 20 min. circa. Durante questo tempo, la resina del reagente di lisi R1 sedimenta in fondo del Cryptube consentito pipettare il surnatante solo nella fase 8. Il surnatante (1.6 ml) contiene il DNA estratto dai batteri lisati. È inoltre possibile centrifugare i Cryotube a 900 x g per 3 min in una centrifuga con un rotore per provette da 4.5 ml. Verificare al tatto che la provetta sia a temperatura ambiente prima di continuare l estrazione. In questa fase, il lisato può essere conservato a +2 C/+8 C per ore. 8. Prelevare 500 µl di surnatante su una colonna di purificazione senza miscelare il lisato su Vortex. Chiudere ciascuna colonna di purificazione con il tappo della provetta di recupero. Nota: Prestare attenzione a non pipettare il pellet formato dalla resina. Se viene pipettata la pallina, rilasciare i 500 μl nel Cryotube ad aspettare nuovamente 5 min. che si riformi il pellet dalla resina oppure centrifugare a 900 x g per 3 min. 9. Centrifugare per 10 min a x g. Se la temperatura della centrifuga è programmabile, regolarla di preferenza a 20 C. Nota: Se nella colonnina di purificazione si formano dei grumi, aumentare il tempo di centrifugazione senza aumentare la velocità di centrifugazione. 10. Gettare via il liquido contenuto nel flacone di recupero. 11. Ripetere la fase 8 prelevando di nuovo 500 µl di surnatante, depositandoli sulla stessa colonna di purificazione e chiudere con il tappo del flacone di recupero. 12. Centrifugare ancora per 10 min a x g. Se la temperatura della centrifuga è programmabile, regolarla di preferenza a 20 C. Nota: Se nella colonnina di purificazione si formano dei grumi, aumentare il tempo di centrifugazione senza aumentare la velocità di centrifugazione Verificare che tutto il surnatante sia filtrato attraverso la colonnina. Se ciò non avviene centrifugare di nuovo. Se dopo una seconda centrifugazione compaiono ancora delle vischiosità, proponiamo un protocollo alternativo di purificazione. Fare riferimento al punto 4 Estrazione e purificazione del DNA per campioni ostruenti. 13. Aggiungere 100 µl di reagente R2 nella colonna di purificazione. 14. Eliminare il flacone di recupero. Coprire la colonna di purificazione con un nuovo flacone di recupero pulito e girarla sottosopra. 15. Centrifugare per 3 min. a x g. Se la temperatura della centrifuga è programmabile, regolarla di preferenza a 20 C. Eliminare la colonna di purificazione. Nota: in questa fase il cappuccetto può non essere chiuso. 16. Recuperare il flacone di recupero contenente 100 µl di soluzione di DNA purificato. Utilizzare 5µl di questa soluzione per ciascuna reazione PCR in tempo reale. La soluzione di DNA può essere conservata per diversi mesi a -20 C. 4. Estrazione e purificazione del DNA di campioni ostruenti Questo protocollo alternativo è al di fuori dello scopo del certificato di AFNOR VALIDATION. 1. Piegare delicatamente la membrane in 2, tre volte di seguito per ottenere un cono (cfr. Schema die piegature della membrane in Appendice) 2. Prendere la membrane con le pinze e introdurla in un Cryotube contenente 2 ml di R1. La punta del cono formato dalla membrana dopo la piegatura deve essere diretta verso l alto del Cryotube (cfr. Schema di piegature della membrane in Appendice) 3. Miscelare su Vortex per 20 sec. Nota: Verificare che la membrana resti ben immerso nella soluzione R1. 4. Incubare per 15 min. in un bagnomaria a 95 C ± 5 C. Coprire con coperchio se il bagnomaria ne è dotato. 5. Miscelare su Vortex per 20 sec. 6

7 6. La membrana deve essere spremuta e gettata via. Trasferire il campione (compreso la resina) in una provetta da 2 ml. Eliminare il Cryptube. In questa fase, il lisato può essere conservato a +2 C/+8 C per ore. 7. Aggiungere 200 µl di soluzione W2 fredda (+4 C). 8. Miscelare su Vortex per 5 sec. 9. Incubare il surnatante per 15 min. a 4 C ± 2 C (in un frigorifero). 10. Centrifugare a x g per 15 min. a 4 C. 11. Aggiungere 500 µl di surnatante alla colonna di purificazione, senza miscelare il lisato su Vortex. Chiudere ciascuna colonna di purificazione con il tappo del flacone di recupero. Nota: Prestare attenzione a non pipettare il pellet formato dalla resina. Se viene pipettata la pallina, rilasciare i 500 μl nella provetta ed aspettare nuovamente 5 min. che si riformi il pellet dalla resina oppure centrifugare a 900 x g per 3 min. 12. Centrifugare a x g per for 10 min. a 20 C Nota: Se nella colonnina di purificazione si formano dei grumi, aumentare il tempo di centrifugazione senza aumentare la velocità di centrifugazione. 13. Gettare via il liquido contenuto nel flacone di recupero. 14. Ripetere la fase 11 prelevando di nuovo 500 µl di surnatante, depositandoli sulla stessa colonna di purificazione e coprire con il tappo del falcone di recupero. 15. Centrifugare ancora a x g per 10 min a 20 C. Note: Se nella colonnina di purificazione si formano dei grumi, aumentare il tempo di centrifugazione senza aumentare la velocità di centrifugazione. Verificare che tutto il surnatante sia filtrato attraverso la colonnina. Se ciò non avviene centrifugare di nuovo. 16. Gettare via il liquido contenuto nel flacone di recupero. 17. Aggiungere 250 μl di soluzione R Centrifugare a g per 5 min. a 20 C. 19. Aggiungere 100 μl di soluzione R2 alla colonna di purificazione 20. Eliminare il flacone di recupero e coprire la colonna di purificazione con un nuovo flacone di recupero e girarla sottosopra. 21. Centrifugare a g per 3 min. a 20 C. Eliminare la colonna di purificazione. Nota: In questa fase il cappuccetto può non essere chiuso. 22. Conservare la fiala contente i 100 μl della soluzione di DNA purificato. Utilizzare 5 µl di questa soluzione DNA per ciascuna reazione di PCR in real-time. Il calcolo del fattore Z è dettagliato nel paragrafo 8 (Z = 36). La soluzione di DNA può essere conservata per diversi mesi a -20 C. VIII. CALCOLO DELLA FRAZIONE DI CAMPIONE ANALOZZATO Qualsiasi metodo d analisi che includa una fase di estrazione seguita da una fase di rilevazione deve essere accompagnata dal calcolo della frazione del campione processato che è analizzato durante la rilevazione finale. Questo valore è preso in considerazione nel calcolo del limite di rilevazione e di quello di quantificazione dell intero metodo, ed è usato per dare un risultato finale in un test quantitativo. Per far ciò si deve calcolare la frazione rimanente rispetto al campione iniziale in ciascuna fase del protocollo (concentrazione, eliminazione, ecc.). Il fattore Z corrisponde al denominatore della frazione analizzata ed è specifico per ciascun protocollo d estrazione. 1. Nel caso venga analizzato 1 l di acqua e 5 µl di DNA sono analizzati utilizzando la PCR, il valore Z per il protocollo Aquadien è 32. 7

8 Il valore Z è calcolato nel modo seguente: Fase di filtrazione del campione: 1000 ml dell acqua è filtrato al di fuori di 1000 ml. La frazione filtrata è 1/1. Z 1 = 1 Fase di estrazione e purificazione di DNA: 1 ml del surnatante R1 è processato attraverso la colonna al di fuori di 1,6 ml. La frazione purificata è 1/1.6. Z 2 = 1.6 Fase di analisi di PCR: 5 μl della soluzione di DNA estratta sono utilizzato per la PCR sui 100 µl eluiti. La frazione analizzata in PCR è 5/100 = 1/20. Z3 = 20 Il valore Z totale di protocollo Aquadien è: Z = Z 1 x Z 2 x Z 3 = 1 x 1.6 x 20 = 32. Il risultato bruto della PCR dovrebbe essere moltiplicato per 32 per ottenere la quantità finale di batteri contenuti nel campione di partenza, espresse in Unità Genomiche (UG) per litro di campione d acqua. Se il volume d acqua filtrata è differente da un L, considerarlo durante questi calcoli. 2. Nel caso venga analizzato 1 l di acqua e 5 µl di DNA sono analizzati utilizzando la PCR, il valore Z del protocollo per i campioni ostruenti è 36. Il valore Z è calcolato nel modo seguente: Fase di filtrazione del campione: 1000 ml dell acqua è filtrato al di fuori di 1000 ml. La frazione filtrata è 1/1. Z 1 = 1 Fase di estrazione e purificazione di DNA: 1 ml del surnatante R1 è processato attraverso la colonna al di fuori di 1.8 ml (1.6 ml di R ml di W2). La frazione purificata è 1/1.8. Z 2 = 1.8 Fase di analisi di PCR: 5 μl della soluzione di DNA estratta sono utilizzato per la PCR sui 100 µl eluiti. La frazione analizzata in PCR è 5/100 = 1/20. Z 3 = 20 Il valore Z totale di protocollo Aquadien per i campioni ostrueni è: Z = Z 1 x Z 2 x Z 3 = 1 x 1.8 x 20 = 36. Il risultato bruto della PCR dovrebbe essere moltiplicato per 36 per ottenere la quantità finale di batteri contenuti nel campione di partenza, espresse in Unità Genomiche (UG) per litro di campione d acqua. Se il volume d acqua filtrata è differente da un L, considerarlo durante questi calcoli Per esempio, se sono filtrati 100 ml, il fattore Z 1 sarà uguale a 10, ed il fattore Z sarà uguale a 360. Informazioni per l acquirente: Cryotube è un marchio depositato di Nunc Aquadien è un marchio depositato di Bio-Rad 8

9 APPENDICE Schema di Piegatura della Membrana x 1 x 2 x 3 Piegare delicatamente la membrana in 2, per tre volte di seguito per ottenere un cono Membrana piegata Cryotube 2 ml di R1 Prendere la membrana con le pinze e introdurla in un Cryotube contenente 2 ml di R1. 9

10 NOTE 10

11 NOTE 11

12 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - Francia Tel.: Rev. B - 09/2010 Fax: Nr.: