PURIFICAZIONE DI DNA

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1 PURIFICAZIONE DI DNA Esistono diverse metodiche per la purificazione di DNA da cellule microbiche, più o meno complesse secondo il grado di purezza e d integrità che si desidera ottenere. In tutti i casi sono necessari i seguenti passaggi: 1. Lisi delle cellule in condizioni controllate che permettano la distruzione delle pareti cellulari, tramite forze meccaniche o digestione enzimatica, e delle membrane cellulari solitamente solubilizzate con detergenti. E' necessario assicurare che il DNA non venga degradato dall'attivazione di nucleasi cellulari; in genere, questo si ottiene aggiungendo al tampone di lisi EDTA, un agente chelante che rimuove i cationi necessari per il funzionamento delle DNasi. 2. Rimozione delle proteine strutturali strettamente associate alle molecole di DNA. Questo scopo viene raggiunto tramite estrazioni con solventi organici (fenolo, cloroformio). In alternativa sono attualmente disponibili metodi cromatografici che consentono di evitare l uso di solventi e di ottenere DNA con un elevato grado di purezza. 3. Separazione del DNA dalle molecole di RNA tramite trattamento con RNasi (DNasi-free)e da componenti a basso peso molecolare tramite precipitazione selettiva del DNA con alcool. Le procedure utilizzate saranno differenti a seconda che si voglia isolare DNA genomico, da cui eventualmente clonare un gene di interesse, oppure DNA plasmidico

2 Estrazione DNA plasmidico La crescita di colonie su un terreno selettivo è un evidenza fenotipica che le cellule sono state trasformate con il plasmide ricombinante Per confermare questo a livello genotipico il DNA plasmidico deve essere amplificato ed isolato Un metodo rapido per purificare una piccola quantità di DNA plasmidico è conosciuto come Mini-Prep

3 AMPLIFICAZIONE E PURIFICAZIONE DNA PLASMIDICO Dopo incubazione a 37 C in stufa per tutta la notte (o/n, over night), sulla piastra Petri compaiono le colonie Batteriche l antibiotico presente nell agar delle piastre permette la crescita alle sole cellule che hanno assunto il plasmide Il plasmide infatti contiene il gene che conferisce resistenza all ampicillina. Come vettore interno è buona norma usare un vettore circolare (controllo positivo) per valutare l'efficacia della reazione, a prescindere dalla bontà dei nostri costrutti. Per scongiurare la presenza, fra le cellule batteriche utilizzate, di ceppi inquinanti, abbiamo effettuato un controllo negativo, non somministrando alcun vettore da trasformare ci si aspetta che le piastre ottenute non presentino alcuna colonia dato che la crescita su terreno selettivo è permessa dal gene di resistenza amp presente, nel vettore plasmidico, ma non nel genoma batterico delle cellule DH5α.

4 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina (mini-prep) Tale metodo permette di ottenere circa 2-10 µg di DNA plasmidico. Da una piastra di cellule trasformate con il plasmide di interesse viene effettuato, in condizioni sterili, l inoculo di una singola colonia in 2 ml di brodo di coltura LB con ampicillina (100 µg/ml), contenuti in un tubo da batteri da 15 ml.

5 Luria-Bertani Broth (LB) NaCl 1% NaCl 1% Bacto tryptone 1% Bacto yeast extract 0,5%

6 Il tubo è incubato per 12 ore circa a 37 C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. 0,9 ml di coltura vengono quindi centrifugati a RPM per 1-3 minuti, allo scopo di ottenere un pellet di cellule batteriche che viene risospeso in 400 µl di soluzione di sospensione, o soluzione 1. (Glucosio ed EDTA) che lega ioni bivalenti come Mg ++ e Ca++ necessari per la stabilità della membrana cellulare e per inbire le DNasi Alla sospensione di cellule ottenuta si aggiungono 400 µl di soluzione di lisi alcalina o soluzione 2. (SDS ed Idrossido di Sodio). SDS, un detergente ionico dissolve i fospolipidi e le proteine costituenti della membrane cellulari. La lisi della membrana rilascia il contenuto cellulare. L Idrossido di Sodio denatura il DNA cromosomico ed il DNA plasmidico (singolo filamento). Il DNA cromosomico si separa completamente in due catene individuali mentre le singole catena di DNA plasmidico rimangono legate l una con l altra

7 La reazione di lisi non deve procedere per più di 5 minuti, trascorsi i quali si aggiungono 400 µl di soluzione 3 (Potassio Acetato, Acido Acetico). necessaria a tamponare il ph e far precipitare grosse molecole provenienti dalle membrane e dalle pareti delle cellule lisate ( SDS-lipidi proteine). A ph neutro, si ha la rinaturazione dei DNA (plasmidico e cromosomico). Tuttavia le lunge catene di DNA cromosomico rinaturano parzialmente e vengono intrappolate con con le grosse molecole e precipitano ( anche l RNA ad alto peso molecolare). Il DNA plasmidico è completamente rinaturato in molecole a doppia catena E rimane in soluzione

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9 Dopo una centrifugazione di 15 minuti a RPM, viene recuperato il sopranatante, contenente DNA plasmidico, RNA a basso peso molecolare e proteine batteriche. Viene aggiunto al sopranatante un volume di fenolo-cloroformio fase di estrazione. Si centrifuga per qualche minuto per avere la separazione delle fasi. La fase acquosa è la superiore è contiene il DNA plasmidico. Alla fase acquosa prelevata si aggiungono 0,7 volumi (V) di isopropanolo e si inverte più volte Dopo una centrifugazione di 10 minuti a 12000RPM, viene eliminato il sopranatante e si risospende il pellet (DNA plasmidico) con 20 ul di H2O o TE (tampone Tris-EDTA). Si aggiunge Rnase che distrugge l RNA per avere una preparazione relativamente pulita di DNA plasmidico

10 La figura illustra gli step di estrazione con fenolo-cloroformio (A), la successiva precipitazione con etanolo assoluto (B), il lavaggio con etanolo (C) del pellet ottenuto dopo centrifugazione, l essiccamento all aria (D) e la risospensione in acqua o TE (E) La deproteinizzazione è più efficiente se si utilizzano due solventi organici anziché uno. Benché il fenolo denaturi le proteine, non inattiva del tutto le ribonucleasi

11 Purificazione attraverso Cromatografia Questo metodo si basa sulla lisi delle cellule in condizioni alcaline con conseguente denaturazione del DNA, seguita da rapida rinaturazione e successiva purificazione del DNA plasmidico mediante cromatografia a scambio anionico. IL DNA, carico negativamente, si lega a gruppi DEAE carichi positivamente e fissati su una resina. La particolare resina in questa purificazione (QIAGEN) permette di eluire, mediante l uso di tamponi a concentrazioni saline medie, molecole quali RNA, proteine, carboidrati e piccoli metaboliti, e, a concentrazioni saline più alte, viene eluito solo il DNA plasmidico.