Identificazione e studio delle Cellule Staminali Tumorali del carcinoma della mammella e dell adenocarcinoma del colon

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1 Identificazione e studio delle Cellule Staminali Tumorali del carcinoma della mammella e dell adenocarcinoma del colon Carmelo Lupo Coordinatore Tecnico U.O. Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica Casa di Cura di Alta Specialità La Maddalena Palermo AITIC Riccione maggio 2009

2 Centro OncoBiolgia Sperimentale

3 Referenze

4 Incontri ravvicinati.

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6 Staminali Tumorali

7 Modello di crescita delle staminali tumorali

8 MODELLO GERARCHICO

9 Cellule Staminali Tumorali Sono state identificate in tumori solidi e del sangue Hanno proprietà simili alle normali staminali ma sono in grado di dare origine a cellule che presentano una resistenza maggiore ai farmaci Hanno la capacità di auto-rigenerarsi

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11 Stem cells in breast cancer are CD44+, CD24-/low, ESA+.

12 Nel carcinoma della mammella la percentuale delle staminali tumorali è del 10-20%

13 Cancer stem cells drive metastasis Nature

14 Breast Cancer Stem Cells are Metastatic

15 Progetto Staminali Tumorali APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE

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17 Staminali tumorali come comune denominatore

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19 Prelievo di frammento di carcinoma della mammella in sala operatoria

20 TAGLIO SPECULARE Frammento A: un frammento del tumore per la diagnosi istologica e fattori prognostici Frammento B: il frammento speculare destinato alle colture cellulari

21 Frammento B: Campione chirurgico prelevato e posto in PBS; entro 15 nel Laboratorio di Colture cellulari (criticità per mrna)

22 Dissociazione del tessuto Dissociazione del tessuto tramite enzimi (es: Collagenasi ) Successivamente Tripsina e DNAsi Separazione per centrifugazione della quota cellulare dall estratto e successivi lavaggi

23 Cellule in coltura Le cellule isolate vengono poste in coltura con siero al 20% ed antibiotici in una fiasca da 25 cm2 (terreno di coltura DMEM + Glutamina o RPMI)

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25 Crescita (nelle cellule tumorali manca l inibizione da contatto) 7g Numero di cellule 4g tempo La crescita cellulare ha un andamento gompertziano

26 Prima settimana: stato di confluenza, attese 2 milioni di cellule alla conta (popolazione eterogenea) Distacco mediante EDTA o Tripsina Conta Risemina in due fiasche da 75 cm2 ed una da 175 cm2 Attesa di circa un altra settimana

27 Sorting Popolazione cellulare eterogenea (staminali tumorali, tumorali adulte) Necessario fare un SORTING (citofluorimetro; sistema sfere magnetiche)

28 CITOFLUORIMETRIA

29 ANTIGENI CELLULE TUMORALI STAMINALI DELLA MAMMELLA CD44+ CD24-/low ESA+(antigene superficiale epiteliale)

30 Cellule staminali tumorali del carcinoma della mammella Dopo circa un mese avremo le nostre staminali tumorali del tumore della mammella. Lo scopo dello studio è finalizzato all identificazione di un fenotipo e di un genotipo Proiettare la tecnica per isolare le staminali del tumore del colon.

31 Abbiamo sacrificato alcune cellule in coltura per allestire citologici su strato sottile ThinPrep ed effettuare reazioni immunoistochimiche con: CK CD44 CD133

32 Abbiamo osservato: Popolazione eterogenea

33 CK+

34 CK+

35 CK+ positività apicale

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39 Negatività Perché cellule epiteliali di mammella sono negative per CK?

40 Marcatore di staminalità CD44

41 CD44+

42 CD44+

43 CD44+

44 CD44+

45 CD133 expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer Horst D, Kriegl L, Engel J, Kirchner T, Jung A. Pathologisches Institut der Ludwig-Maximilians-Universität München BJC 2008 Oct 21;99(8): Epub 2008 Sep 9

46 COLON: CD133

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48 CD133

49 Microdissettore laser Estrazione DNA Estrazione RNA Sequenziamento per mutazioni note e non note Mappe Proteomiche

50 Studio delle staminali tumorali in Anatomia Patologica e comparazione con il dato istologico: Tecniche immunoistochimiche PTEN; CD133; CD44; CD24, ESA; Tecnica FISH Determinazione dello status dei geni

51 FENOTIPO Approccio proteomico Mappa proteomica (comparare profili proteomici con cellule tumorali adulte sfruttando proteine già note)

52 Sequenziamento DNA Analisi mutazionale di segmenti di DNA delle staminali per identificare le mutazioni genetiche coinvolte: Sequenziamento K-RAS, B-RAF, Microarray

53 Elettroferogramma K-RAS

54 Mappa proteomica Immunoistochimica DATA-MATCHING Follow-up FISH Microarray

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56 Abbiamo il potenziale giusto

57 Perché farlo? Potremmo avere il fenotipo delle cellule staminali tumorali che, comparata con mappe già note di cellule tumorali adulte, potrebbe evidenziare ulteriori proteine presenti solo nelle staminali tumorali. Identificare proteine ignote o comunque specifiche per le staminali tumorali potrebbe portare alla creazione di anticorpi/farmaci specifici e selettivi. Identificare il genotipo delle staminali tumorali potrebbe aiutarci a capire il pathway degli errori/mutazioni genetici (amplificazioni, delezioni, traslocazioni) coinvolti.

58 Cancer stem cell TARGET THERAPY

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60 Prospettive future Radiology Radiotherapy Oncology Nuclear medicine

61 Grazie per l attenzione