Analisi molecolare dei geni

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1 Analisi molecolare dei geni

2 Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari

3 Ogni frammento di DNA ha una caratteristica temperatura di fusione (Tm-> melting temperature) Maggiore e il contenuto delle G C, maggiore e la Tm Tm-> temperatura alla quale meta delle molecole di DNA sono denaturate in singoli filamenti

4 Effetto ipercromico delle basi nucleotidiche, all aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD a 260nm

5 Applicazioni sperimentali della complementarietà delle basi Le cinetiche di riassociazione suggeriscono che il DNA umano e formato da: fast Cinetica di rinaturazione del genoma umano intermediate slow

6 Fast: DNA altamente ripetuto, presente in numerose copie (trasposoni inattivi, copie geniche inattive, ripetizione di sequenze semplici, sequenze ripetute in tandem, duplicazioni segmentali) Intermediate: DNA mediamente ripetuto Slow: DNA presente in sequenze uniche

7 Composizione del genoma umano

8 PCR (Polymerase Chain Reaction o reazione a catena della polimerasi) 1 2 Gene a sequenza nota La PCR permette l amplificazione di un milione di volte o piu di una sequenza specifica di DNA che e gia nota o di cui sono note delle piccole sequenze all estremita del gene

9 La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: -isolare un gene (enzimi di restrizione) -clonaggio (amplificazione) vettori -sequenziamento -funzione

10 VETTORE PLASMIDICO -si replica autonomamente rispetto al cromosoma batterico -possiede un polylinker -possiede un marcatore di selezione

11 Vettore di espressione

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13 Oligonucleotidi o primers

14 Oligonucleotidi o primers

15 Reazione 2 n dove n=numero di cicli Si possono ottenere informazioni sulla sequenza a partire da ridottissime quantita di DNA come sangue, capelli, etc PCR (Polymerase Chain Reaction) DNA polimerasi dntp Mg2+

16 Southern/Northern Blot Ibridazione con sonda di DNA

17 - PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA CERCANDO - PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA) - PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE - PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI CON ALTRE TECNICHE) - PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET

18 DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENI Anemia falciforme RFLP (Restriction fragment lenght polymorfism) polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione

19 Applicazione del DNA ricombinante: Diagnosi dell anemia falciforme tramite Southern Blot La mutazione abolisce il sito MstII

20 Ibridazioni in situ

21 Il sequenziamento del DNA (Sanger)

22 Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA

23 il metodo di Sanger 2-3 DIDEOSSINUCLEOTIDI DNA stampo DNA polimerasi dntp primer marcato Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dntp sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddntp in ciascuna provetta

24 Sequenziamento del DNA: il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legge la sequenza mano mano sintetizzata dal basso verso l alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) all estremità 5 mentre il nucleotide T è all estremità 3. 5 GCTCCACGTAACGT3 Questa sequenza è complementare al filamento stampo.

25 ddntp marcati con fluorofori

26 cromatogramma

27 Mappe fisiche di molecole di DNA basate su taglio di enzimi di restrizione (Mappe di Restrizione) Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNA riconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici e con una sequenza ben precisa.

28 Gli enzimi di restrizione sono degli enzimi che i batteri utilizzano per difendersi dagli attacchi di un DNA estraneo

29 Frammenti di restrizione La mobilita di ciascun fammento e inversamente proporzionale al logaritmo della sua lunghezza

30 Mappe di restrizione Rappresentano delle mappe fisiche del DNA in cui i siti di restrizione fungono da marcatori. Forniscono le reali distanze in coppie di basi tra 2 geni elettroforesi

31 A COSA SERVE L ANIMALE TRANSGENICO? RIPRODUZIONE DI MODELLI DI MALATTIE UMANE IN TOPI ANALISI IN VIVO DELLA FUNZIONE O MANCANZA DI UN GENE (analisi di ridondanza, fenotipica, sviluppo etc.) DETERMINAZIONE DI APPROCCI FARMACOLOGICI IDONEI SPERIMENTABILI SU ANIAMALI CHE RIPRODUCONO LA PATOLOGIA UMANA ANIMALE TRANSGENICO COME BIOREATTORE O PRODUTTORE DI PROTEINE UMANE DA POTER PURIFICARE E USARE COME FARMACO

32 Animali transgenici fondatori fondatori progenie

33 MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI

34 ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI blastocisti Cellule embrionali

35 PROPRIETA DELLE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI (ES) Possono dividersi illimitatamente in modo simmetrico senza differenziare Mantengono un normale corredo cromosomale Producono cellule di tipo ecto-meso ed endodermico Si integrano in tutti i tessuti fetali durante lo sviluppo Colonizzano la linea germinale per originale le cellule delle gonadi Sono clonogeniche, ovvero da una singola cellula si origina una colonia di cellule geneticamente identiche Esprimono il fattore di trascrizione Oct-4, che attiva una serie di geni che mantengono la cellula in uno stato proliferativo e indifferenziato Posono essere indotte a proliferare o differenziare Spendono la maggior parte del loro ciclo cellulare nella fase S e non necessitano di stimoli esterni per proliferare Non mostrano inattivazione dell X

36 Vantaggio nell uso delle ES - Possono essere sottoposte a diverse manipolazioni genetiche prima di reiniettarle nella blastocisti ricevente - Il transgene puo essere coespresso insieme ad un gene marcatore (neo) che consente di selezionare solo le cellule contenenti il transgene (importante soprattutto nei casi di mutagenesi mirata in cui deve avvenire ricombinazione omologa)

37 a b Progenie con cellule germinali portatrici del transgene Eredita mendeliana del transgene Cellule germinali aploidi 50% + 50% -

38 Come introdurre il transgene nella cellula zigote o nelle cellule staminali embrionali? INIEZIONE NEL PRONUCLEO DI PLASMIDI INEFFICIENTE E COSTOSO ONCORETROVETTORI MoMLV SILENZIAMENTO DEL VETTORE DURANTE LO SVILUPPO LENTIVETTORI NON SOGGETTI A SILENZIAMENTO