Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi

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2 Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi

3 il metodo di Sanger 2-3 DIDEOSSINUCLEOTIDI Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica il primer (lungo 15 nucleotidi) ** I dntp sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddntp in ciascuna provetta

4 Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l estremità 5 mentre il nucleotide T è all estremità 3. 5 GCTCCACGTAACGT3 Questa sequenza è complementare al filamento stampo.

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7 ONCOGENI originati per traslocazioni cromosomiche (cariotipi alterati): Bcr-Abl Cromosoma filadelfia associato alla Leucemia Mieloide Cronica E presente nei leucociti

8 Sia bcr che abl sono delle tirosina chinasi ma nella forma ibrida si forma una tirosina chinasi priva della regione regolativa

9 FISH: IBRIDAZIONE IN SITU

10 fondatori fondatori progenie

11 SOUTHERN BLOT -DNA BERSAGLIO DIGERITO CON ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

12 TRASMISSIONE DEL TRANSGENE ALLA PROGENIE FONDATORE 18 FONDATORE 14 progenie progenie

13 SOUTHERN PER SAGGI SUGLI RFLP DETRMINAZIONE DI POLIMORFISMI di lunghezza dei frammenti di restrizione O DI MUTAZIONI NON ASSOCIATE A MALATTIE COMPARSA DI NUOVI SITI DI RESTRIZIONE POLIMORFISMI -ESISTENZA IN UNA POPOLAZIONE DI DUE O PIU VARIANTI ALLELICHE (VARIANTI DI SEQUENZA PATOLOGICHE E NON) - RFLP polimorfismo dovuto a differenze di dimensione di frammenti di restrizione allelici causati dalla presenza o assenza di un sito di restrizione - SNP variazione polimorfica di un singolo nucleotide senza creare o alterare un sito di restrizione (SNP del gene OCA2 per il colore degli occhi) - VNTR schieramenti di sequenze ripetute in tandem che variano negli individui per il numero di copie ripetute

14 RFLP

15 DETERMINAZIONE DI RFLP PATOGENI sonda Anemia falciforme Abolisce il sito MstII

16 PCR/RFLP per l analisi l dell anemia falciforme Regione amplificata con la PCR

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18 SOUTHERN PER SAGGI SU VNTR (variable number of tandem repeats - >ripetizioni in tandem di numero variabile) E FINGERPRINT DEL DNA DETRMINAZIONE DI POLIMORFISMI BASATI SU ALLELI CHE DIFFERISCONO PER IL NUMERO DI SEQUENZE BREVI RIPETUTE A SECONDA DEL NUMERO DI SEQUENZE RIPETUTE POSSIAMO DISCRIMINARE UN INDIVIDUO DALL ALTRO

19 1 2 VNTR DI 2 INDIVIDUI DIFFERENTI VNTR VNTR2 Restrizione a monte e a valle delle ripetizioni e Southern in cui si usano tante sonde diverse a seconda dei VNTR che si considerano INDIVIDUO 1 INDIVIDUO 2 Si visualizzano frammenti di altezza differente specifici per ogni individuo

20 PCR/VNTR/STR in genetica forense Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine? La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

21 ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA Il trascrittoma

22 ANALISI DELLA VARIAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA - Da cellule infettate - da trattamenti con agenti tossici o farmaci - da cellule di tessuti patologici - cellule di tessuti durante lo sviluppo embrionale

23 Su piccola scala pochi geni Northern Blot Sonda marcata

24 Analisi su larga scala: microarray O DNA CHIPS - SAGGIO DI IBRIDAZIONE ALTAMENTE MINIATURIZZATO E AUTOMATIZZATO - CLONI DI DNA O SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE (FINO A ) NON MARCATE SONO FISSATE SU UN SUPPORTO SOLIDO (VETRO) - APPLICAZIONE PER ANALISI SU LARGA SCALA DELLA VARIAZIONE DELL ESPRESSIONE GENICA O VARIAZIONE DI DNA

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28 IL TARGET PER IBRIDAZIONE DEL CAMPIONE PUO ESSERE COSTITUITO DA C-DNA O C-RNA -C-RNA maggiore amplificazione del segnale, piu forte il legame RNA-DNA, ma maggiore possibilita di cross-reazioni - c-dna, minore amplificazione del segnale ma risultati piu riproducibili e meno cross-reazione

29 cdna microarray Cy3 Cy5 Total RNA from both the test and reference sample is fluorescently labeled with either Cy3- or Cy5-dUTP using a single round of reverse transcription. If the fluorescently tagged transcripts are, on average, 600 bp, have an average of 2 fluor tags per 100 bp and hybridize to their probe, approximately 12 fluors will be present in a 100 mm 2 scanned pixel from that probe. The fluorescent targets are pooled and allowed to hybridize under stringent conditions to the clones on the array, using a computer controlled slide hybridizator. Efficient mixing of the hybridization fluid should bring more molecules into contact with their cognate probe, increasing the number of productive events.

30 Interpreting microarray results Signal from differentially expressed genes Genes expressed at low levels Equally expressed genes

31 La tecnologia dei microarray permette di determinare il profilo o la variazione di espressione di centinaia di geni su un tessuto o un tipo cellulare, disegnando uno specifico ritratto molecolare della cellula

32 I microarray permettono di determinare una diagnosi e predire una prognosi in molti tipi di cancro umani

33 LIMFOMA DELLE CELLULE B DLBCL 40% PAZIENTI RISPONDE BENE ALLA TERAPIA 60% SOCCOMBE ESISTONO 2 FORME MOLECOLARI DI DLBCL IN BASE AI 2 DIFFERENTI PROFILI DI ESPRESSIONE

34 ANALIZZATE 240 BIOPSIE DI PAZIENTI CON DLBCL MICROARRAY DISTINZIONE DELLA PATOLOGIA IN 3 SOTTOGRUPPI: GC B-cell-like, activated B celllike, type 3 B cell-like Nelle GC B-cell-like ci sono 2 eventi oncogenici determinanti: Traslocazione di bcl-2 Amplificazione di c-rel

35 Aree rosse- >espressione incrementata Aree verdi- >espressione ridotta Sopravvivenza cellulare dopo chemioterapia