Analisi dei dati MLPA con il nuovo Coffalyser.NET. MRC-Holland

Transcript

1 Analisi dei dati MLPA con il nuovo Coffalyser.NET MRC-Holland

2 Contenuti Che cos è il Coffalyser.NET Analisi dei frammenti e del Copy number Interpretazione dei dati

3 Che cos è il Cofffalyser.NET Software gratuito Semplice installazione tramite link online Analisi dei raw data dai sequenziatori Normalizzazione dei segnali dei picchi delle sonde (alleli) Copy number Analisi di Metilazione RNA

4 Vantaggi del Coffalyser.NET Analisi semplice in 2 step seguiti da controlli di qualità Fragment analysis Comparative analysis Collegamento diretto al database MRC-Holland Informazioni sulle Sheet e Size markers Metodi di analisi (impostazioni) Possibilità di importare vari formati di file direttamente dai sequenziatori Riconoscimento affidabile dei segnali Opzioni avanzate di analisi Efficiente stoccaggio dei dati e facilità di accesso

5 Componenti Coffalyser.NET 1. Coffalyser SQL Database 3. Database MRC- Holland 2. Coffalyser Client Software

6 Coffalyser Database nel Client

7 Analisi dei dati di un esperimento (workflow)

8 Normalizzazione I segnali dei picchi sono relativamente proporzionali al numero delle sequenze target presenti in ogni campione Le sequenze target di tutte le sonde nei campioni reference devono avere un numero di copie normale (diploide) Le sequenze target delle sonde reference nei campioni testati devono avere un numero di copie normale (diploide)

9 Strategia di normalizzazione La costante normalizzante (sonde di riferimento) rimane relativamente uguale in tutti i campioni Rimuove effetti sistematici e mette i dati di campioni diversi su una scala comune RatioTPs Sample TP reference TP (? copies ) / RP(2copies ) (2copies ) / RP(2copies ) CopyNumber TPs 2*( RatioTPs )

10 Robustezza aumentata Ogni sonda di riferimento sarà usata per normalizzare ognuna delle sonde testate. La media di tutte le ratio prodotte sarà usata come ratio finale.

11 (RSQ) Campioni di riferimento multipli

12 Normalizzazione

13 Confini arbitrari + statistiche Le aberrazioni possono essere riconosciute con una maggiore sicurezza combinando la valutazione della ratio con la variazione stimata per ogni sonda sui campioni di riferimento.

14 Uso di distribuzioni per tipo di campioni Per campioni con lo stesso profilo genomico, ci aspettiamo una ratio delle sonde che segue una distribuzione normale. Per questo motivo ci aspettiamo che tutte le sonde che hanno come target le sequenze con un numero di copie normali debbano essere intorno a 1.

15 Distribuzione dei campioni di riferimento I campioni di riferimento forniscono una buona indicazione riguardo alla riproducibilità delle sonde MLPA.

16 Statistiche di distribuzione sui campioni di riferimento Stima degli intervalli di confidenza del 95% per campioni dello stesso tipo Media delle ratio delle sonde [campioni di riferimento] Deviazione standard

17 Uso delle boxplots

18 Visualizzazione degli intervalli di confidenza

19 Sonde variabili

20 Alta sicurezza sui risultati delle sonde (<<*) Ratio media Campione testato Ratio media Campioni di riferimento Intervallo di affidabilità del 95% per un campione testato Intervallo 95% di campioni di rif. Intervallo normale arbitrario

21 Bassa affidabilità sui risultati delle sonde (<*) Intervallo di affidabilità del 95% sul campione testato Area ambigua Intervallo arbitrario normale 95% intervallo dei campioni di riferimento

22 Interpretazione delle ratio calcolate Campioni di riferimento intervallo affidabilità 95% Campioni di riferimento intervallo affidabilità 68% Segnale significativamente diminuito ma sempre all interno dei confini (<<) Segnale significativamente diminuito ed oltrepassato il confine arbitrario (<<*) Confini arbitrari

23 Diversi livelli di confronto

24 Tipi di campioni disponibili Distribuzione della probabilità Distribuzione dei campioni di riferimento (verde) Distribuzione dei campioni positivi (giallo) Distribuzione di tutti i campioni (blu)

25 Uso di riferimenti positivi(me-028)