PRELIEVO DI LIQUIDO AMNIOTICO
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- Giordano Di Martino
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2 PRELIEVO DI LIQUIDO AMNIOTICO ANALISI DEL DNA PRELIEVO DI VILLI CORIALI Ivilli coriali e tutte le strutture placentari sono di origine embrionale: di conseguenza la dotazione cromosomica dei singoli elementi cellulari riflette esattamente il corredo cromosomico, o cariotipo, dell embrione. 99 bp 43 bp taglio ASSENTE PRESENTE
3 Questa PCR e in grado di rilevare 1 cellula cancerosa su 10 6 cellule normali
4 CML= Leucemia Mieloide Cronica (Cromosoma Philadelphia) Traslocazione reciproca cromosomi 9 /22 LINFOMA DI BURKITT Traslocazione reciproca cromosomi 8/14 MRD (Minimal Residual Disease): Quota residua minima di cellule neoplastiche (tumori ematologici tipo le leucemie ed i linfomi) non eliminate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche Tali elementi neoplastici, presenti ad un livello inferiore alla capacità di rilevazione delle metodiche convenzionali, sono in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
5 MstII site CCTGAG
6 DETERMINAZIONE DEL SESSO Gene amelogenina 6 bp Y X DETERMINAZIONE DEL SESSO Gene amelogenina cromosoma Y frammento di 112 cb cromosoma X frammento di 106 cb (due frammenti distinti) cromosoma X frammento di 106 cb cromosoma X frammento di 106 cb (due frammenti sovrapposti)
7 DETERMINAZIONE DEL SESSO Gene amelogenina 1 2 M Y X 200 bp 100 bp 50 bp STABILIRE RELAZIONI DI PARENTELA: - TEST DI PATERNITA - IDENTIFICAZIONE PERSONALE - ORIGINE ETNICA 1. MICROSATELLITI 2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILI DELL mtdna
8 MICROSATELLITI: (STR: Short Tandem Repeat) Unità di ripetizione: Numero di unità: 2-5 nucleotidi 40 CARATTERISTICHE DELLE SEQUENZE RIPETUTE Altamente polimorfiche Ereditarietà Mendeliana APPLICAZIONI Medicina LEGALE (criminologia, test di paternità) Identificazione personale (Fingerprint)
9 ETEROZIGOSITA 70% MICROSATELLITI UTILIZZATI Locus Ripetizioni TH01 Tirosina Idrossilasi (int. 1) (CATT)5-12 vwf Fattore vonwillebrand (int.40) (TCTA)9-15 DM1 Miotonina (3 UTR) (CTG)5-40
10 AUTORADIOGRAFIA GEL ACRILAMIDE DENATURANTE vwf Indagini in medicina forense 10
11 Specie: Glycine max (SOIA) P- 35S CTP CP4 EPSPS NOS3' P- 35S: promotore del Cauliflower mosaic virus CTP: sequenza di un chloroplast transit peptide da Petunia hybrida che funge da peptide segnale per il transito del prodotto transgenico nel cloroplasto CP4 EPSPS: gene della 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasi da Agrobacterium sp. (strain CP4) che conferisce la resistenza al glifosato, ingrediente attivo dell'erbicida Roundup NOS 3 : terminatore del gene della nopalina sintasi da Agrobacterium tumefaciens AZIENDA NOTIFICANTE: Monsanto
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13 - Diagnostica molecolare nell infezione da virus dell AIDS (HIV-1) - Diagnostica molecolare nell infezione da virus dell epatite C (HCV)
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15 HIV-1 M= MAJOR GROUP 9 sottotipi: A, B, C, D, F, G, H, J and K.
16 Le metodologie di diagnosi dell infezione da HCV e HIV: Per l'identificazione dell'infezione da HIV e HCV sono disponibili varie metodiche, basate sulla identificazione degli anticorpi prodotti dal sistema immunitario contro il virus (metodiche sierologiche) oppure sulla ricerca di antigeni e molecole del virus stesso (metodiche virologiche). Ai fini della diagnosi di infezione attualmente vengono utilizzati il test ELISA ed il test Western-Blot.
17 METODICHE SIEROLOGICHE 1. ELISA 2. WESTERN BLOTTING METODO ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Test Immunoenzimatico (ELISA): è la metodica utilizzata per il test di screening, in quanto di facile esecuzione e di costo limitato. Questo test ricerca gli anticorpi prodotti contro alcuni antigeni virali, (gp 41 e gp120-hiv), che dopo una prima infezione restano nell'organismo per tutta la vita. Il test ha una sensibilità di oltre il 95%, ma in alcuni casi si possono avere delle risposte errate: f a l s i p o s i t i v i : i l t e s t r i s u l t a p o s i t i v o i n a s s e n z a d i i n f e z i o n e. P u ò s u c c e d e r e i n p e r s o n e con malattie che alterano la funzione del sistema immunitario p o r t a n d o a l l a p r o d u z i o n e d i a n t i c o r p i a n o m a l i ( e s : leucemie, linfomi, malattie autoimmuni, gravi epatopatie, ecc.); f a l s i n e g a t i v i : i l t e s t r i s u l t a n e g a t i v o a n c h e s e l ' i n f e z i o n e è p r e s e n t e. P u ò s u c c e d e r e i n p e r s o n e c h e s i s o n o i n f e t t a t e m o l t o recentemente, ma nelle quali non si sono ancora formati gli a n t i c o r p i c h e r e a g i s c o n o c o n i l t e s t ; q u e s t o a v v i e n e s o l i t a m e n t e n e l l e p r i m e s e t t i m a n e ( o m e s i ) d o p o i l contagio (periodo finestra).
18 WESTERN BLOTTING Western Blot (WB): è un test dotato di maggiore specificità e sensibilità, utilizzato per confermare la positività di un test ELISA. Questa metodica permette di evidenziare la presenza di anticorpi diretti contro le maggiori proteine virali: il test viene definito positivo quando sono presenti almeno 2 degli anticorpi principali; se il test risulta dubbio o indeterminato va ripetuto dopo alcuni mesi.
19 METODICHE VIROLOGICHE 1. ANTIGENEMIA 2. RICERCA DELL RNA VIRALE
20 RICERCA DEL VIRUS NEL SANGUE Viremia (HIV-RNA, HCV-RNA) Consente di ricercare molecole di RNA virale, la cui quantità nel sangue è direttamente proporzionale al grado di attività replicativa del virus. La viremia viene espressa in numero di copie di VIRUS per ml di sangue; ci sono vari tipi di test che possono essere utilizzati per la determinazione della viremia ma quello più accreditato è la Q-PCR. Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction): è la metodica più diffusa, ed ha un range di sensibilità tra 150 e di copie; REAL TIME Standard PCR : STANDAR curvecurve
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