Problematiche di Laboratorio nell applicazione del Protocollo regionale

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1 Problematiche di Laboratorio nell applicazione del Protocollo regionale UOC di Microbiologia e Virologia DAI di Patologia e Diagnostica AOUI di Verona MALATTIE TRASMESSE DA VETTORI E SORVEGLIANZA DELLE FEBBRI ESTIVE Verona 16 Maggio 2013

2 Malattie Trasmesse da Vettori e Sorveglianza delle Febbri Estive Piano regionale - obiettivi Individuare in tempi rapidi possibili introduzioni della malattia nell area geografica indenne Verificare la reintroduzione nell area infetta Tutelare la salute degli animali Attuare misure di protezione per la popolazione umana

3 West Nile Virus Dengue -Chikungunya Diagnosi Sintomi clinici non specifici Laboratorio fondamentale: Parametri connessi con la replicazione virale (primo stadio dell infezione) Parametri connessi con la risposta anticorpale

4 WNV - Dengue - Chikungunya ARBOVIRUS Famiglia Flaviviridae, Genere Flavivirus Dengue virus 1-4: Dengue fever, DHF*, DSS* *pazienti precedentemente infetti con sierotipo differente dal sierotipo causa di infezione secondaria West Nile virus: WNF, WNND Famiglia Togaviridae, Genere Alphavirus Chikungunya virus

5 WNV Diagnosi di Laboratorio Isolamento del virus (sangue e urine) coltura (possibilità di sequenziare l isolato) metodi molecolari RT-PCR Anticorpi IgM (anche su liquor) IgG aumento del titolo anticorpale confermato con test di neutralizzazione (PRNT) tempo di comparsa: IgM 1 settimana IgG 15 giorni

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7 WNV Diagnosi di Laboratorio Problematiche test sierologici IgM possono persistere per più di un anno dopo infezione acuta Cross-reattività anticorpi con altri flavivirus (es. TBE) Test di neutralizzazione specifico ma può essere neutralizzato da altri flavivirus IgM non sono neutralizzabili Test di conferma in BSL3, tempi lunghi

8 WNV Diagnosi di Laboratorio Problematiche test molecolari Viremia bassa e di breve durata Genetica diversa (lineage) Labilità, degradazione del genoma RNA

9 WNF Diagnosi di Laboratorio Strutture livello B Ricerca anticorpi IgM IgG con metodo immunoenzimatico Positivo inviare campione Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova

10 WNF Diagnosi di Laboratorio Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova Ricerca anticorpi IgM IgG (test ELISA) Conferma con test neutralizzazione Ricerca WNV-RNA real time RT-PCR Sequenziamento genomico Isolamento in coltura

11 Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus WNND Caso possibile Segni clinici febbre >38.5 C manifestazioni neurologiche: encefalite meningite a liquor limpido poliradicoloneurite paralisi flaccida acuta liquor limpido

12 Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus WNND Caso probabile Segni clinici e Almeno uno dei seguenti criteri di laboratorio: Presenza di anticorpi IgM anti WNV (met. ELISA) Sieroconversione (met. ELISA) Aumento di 4 volte del titolo di anticorpi IgG anti WNV (met. ELISA) in due prelievi consecutivi (a distanza > 5 giorni, preferibilmente 15-20giorni)

13 Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus WNND Caso confermato Segni clinici e Almeno uno dei seguenti criteri di laboratorio: Isolamento del virus WN nel sangue o nel liquor Presenza di anticorpi IgM nel liquor (met.elisa) WNV-RNA positivo (met. RT-PCR) nel sangue o nel liquor Rilevazione di un titolo elevato di WNV IgM e IgG (met. ELISA) confermato con test di neutralizzazione PRNT)

14 Dengue Diagnosi di Laboratorio Ricerca anticorpi IgM e IgG con test rapidi e test ELISA Conferma test neutralizzazione DENV-RNA real time RT-PCR Tipizzazione tipo specifica real time RT-PCR Sequenziamento Isolamento virale in coltura

15 Dengue Diagnosi di Laboratorio Strutture livello B Test rapidi immunocromatografici Ricerca antigene NS1 + Ricerca anticorpi IgM e IgG Un solo test positivo: caso probabile Due test positivi: sensibilità molto alta inviare campione Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova

16 Dengue Diagnosi di Laboratorio Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova Ricerca anticorpi IgM IgG (test ELISA) Conferma con test neutralizzazione Ricerca DENV-RNA real time RT-PCR Tipizzazione dei casi positivi real time RT-PCR tipo-specifica Sequenziamento genomico Isolamento in coltura

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18 Major diagnostic markers for dengue infection Peeling, R. W. et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nature Reviews Microbiology 8, S30 S37 (2010).

19 Chikungunya Diagnosi di Laboratorio Ricerca anticorpi IgM test rapidi IgG e IgM test ELISA, test in Immunofluorescenza Conferma CHIKV-RNA real time RT-PCR e RT-PCR Isolamento virale in coltura Aumento del titolo anticorpale

20 Chikungunya Diagnosi di Laboratorio Strutture livello B Ricerca anticorpi IgM test rapido immunocromatografico Falsi negativi nei primi 7 giorni di febbre Forte sospetto clinico (anche se test rapido negativo) inviare campione Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova

21 Chikungunya Diagnosi di Laboratorio Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova Ricerca anticorpi IgM IgG (test immunofluorescenza) Ricerca CHIKV-RNA real time RT-PCR e RT-PCR Sequenziamento genomico Ricerca mutazione A226V nel gene E1: favorisce trasmissione tramite Aedes albopictus Isolamento in coltura

22 Inviare sempre la scheda compilata I campioni di siero, CSF, sangue in EDTA e urine possono essere conservati a 4 C fino a 72 ore. Raccogliere subito siero, plasma, e urine per i test sierologici e molecolari. Poco utile un protocollo in due fasi con test di screening e test di secondo livello.

23 Compilare sempre la scheda, indicando sempre: -data inizio sintomi -Sintomi -Vaccinazioni pregresse -Eventuali precedenti risultati di laboratorio (anticorpi anti-wnv e altri flavivirus con test ELISA o IFA) -Segnalare se NON sono stati eseguiti test di primo livello. -Info medico richiedente. Inviare sempre i seguenti campioni: -Almeno 1 provetta di sangue per sierologia -Almeno 2 provette di sangue intero in EDTA -Un campione di urina in contenitore sterile. Inviare sempre i campioni di followup a distanza di 15 giorni (utile anche follow-up ravvicinato)

24 Inviare sempre la scheda compilata Rischio elevato di test rapidi IgM/IgG falsamente positivi nei casi autoctoni WN Rischio di risultati falsi negativi con i test rapidi come screening. Il test rapido è utile perchè eseguibile in urgenza. I campioni di siero, sangue in EDTA e urine possono essere conservati a 4 C fino a 72 ore. Raccogliere subito siero, plasma, e urine per i test sierologici e molecolari.

25 Compilare sempre la scheda, indicando sempre: -Data inizio sintomi -Sintomi -Paesi visitati -Vaccinazioni pregresse -Eventuali precedenti risultati di laboratorio. -Segnalare se NON sono stati eseguiti test di primo livello. -Info medico richiedente. Inviare sempre i seguenti campioni: -Almeno 1 provetta di sangue per sierologia -Almeno 1 provetta di sangue intero in EDTA -Un campione di urina in contenitore sterile. Inviare sempre un campione di siero a distanza di giorni per i pazienti DENV RNA-negativi (per test di neutralizzazione).

26 Laboratorio di riferimento regionale UOC Microbiologia e Virologia - Azienda Ospedaliera di Padova Per migliorare la diagnosi laboratoristica e la conferma dei casi è utile centralizzare i test presso il Laboratorio di Rifermento Regionale (come per es. in Emilia-Romagna e altri Paesi Europei). Approccio diagnostico integrato per la conferma rapida dei casi. Personale altamente qualificato con ampia esperienza e capacità di set-up rapido di nuovi test diagnostici. Tempi rapidi di riposta (6-48 ore dal ricevimento del campione) Costi contenuti grazie all esecuzione di test in house. No costi aggiuntivi per il trasporto dei campioni (si eseguono già routinariamente test diagnostici per tutti gli ospedali del Veneto). Elevata qualità delle prestazioni (unico laboratorio clinico italiano accreditato ISO 15189). Partecipazione regolare a VEQ e network per diagnostica di infezioni emergenti (WNV, DENV, Hantavirus, CCHFV, influenza virus, coronavirus, etc.) Laboratorio BSL3 per colture virali. Disponibili test per la diagnosi differenziale.

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28 diagnosi positivi pd non da WNV IgM tutti pos WNV IgG 80% pos proiettare 16 liquor neuroinvasiva WNV IgM tutti pos WNV 44% IgG pos Interferenti infez da altri flaviv mono inf cmv malaria Confermati con prnt

29 WNV Rna non da proiettare Plasma - positivo 33% dei pazienti con malattia neuroinvasiva 20% dei pazienti con febbre Urina più sensibile RT-PCR rileva la presenza per tempi più lunghi anche un mese dall esordio dei sintomi ; carica virale 30X RNA pos coltura