La diagnostica di laboratorio

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1 La diagnostica di laboratorio Maria Rosaria Capobianchi, Antonino Di Caro, Concetta Castilletti, WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola

2 La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola FAQ 1. Possono essere eseguiti test diagnostici nei laboratori locali (urgenza, microbiologia, virologia, ecc.) prima di avere il risultato del test per Ebola? SI: se si adottano le adeguate misure di protezione il rischio per i laboratoristi èmolto basso in caso di bassa probabilitàdi malattia da virus ebola, e basso in caso di elevata probabilità

3 Prelievi Valutazione del rischio Unlikely to have a VHF Low possibility of VHF High possibility of VHF Confirmed VHF Prelievi Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire l adozione di adeguate misure di biosicurezza Inviare i campioni al laboratorio locale in contenitori chiusi e infrangibili

4 Indagini chimico cliniche Emocromo elettroliti transaminasi PCR coagulazione ecc. Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco, privilegiando i POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in modo automatico Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste misure, inviare i campioni allo Spallanzani La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola

5 Diagnostica differenziale Malaria Dengue Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi Epatiti Altre febbri emorragiche virali FAQ 2. Il test di malaria può essere eseguito in loco? Si, se si adottano adeguate precauzioni Privilegiare il test rapido (POCT) le positività vanno confermate con i test convenzionali In PS l operatore èprotetto dai dispositivi di protezione e dalle procedure In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa, proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi In caso di impossibilitàdi eseguire il test in loco, o in caso di elevata probabilitàdi MVE, la ricerca del parassita malarico può essere eseguita all INMI Test rapido (risultato comunicato in tempo reale) Conferma con goccia spessa

6 La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola Il virus ebola, come gli altri filovirus, èun virus di gruppo di rischio 4 Alta contagiosità Elevata mortalità Assenza di terapia specifica Assenza di vaccini La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4 non èassimilabile ad analoghe procedure per microrganismi di gruppo inferiore, in quanto presenta requisiti strutturali, professionali ed organizzativi peculiari.

7 Difficoltà del laboratorio Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una diagnosi differenziale ad ampio spettro Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati Scarsitàdi materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi diagnostici Necessitàdi partecipare ai network internazionali per poter accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati Necessitàdi sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma Necessità di laboratori ad alto biocontenimento Capacitàdiagnostiche per Ebola allo Spallanzani Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un test iniziale di screening e vari test successivi di conferma Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi filogenetica Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta (IgM e IgG) Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative, nonchéverso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa, Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.

8 Algoritmo di laboratorio Blood specimens sent to BSL3/4 VHF national reference laboratory Cinetica dell RNA (SUDV Uganda 2000) L RNA virale èpresente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi; la sensibilità dei test non è un problema rilevante Towner, J Virol 2004

9 Ricerca del virus mediante test di biologia molecolare (EBOV-RVNA) Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA con RT-PCR Real-Time Conferma dei positivi con un metodo basato su un target diverso, ed esecuzione di una PCR classica Caratterizzazione mediante sequenziamentodella regione amplificata con PCR classica La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili via Web Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico 17 Tempi di risposta Dall arrivo dei campioni al laboratorio di virologia dello Spallanzani, attivo h24 Test rapido malaria 1 ora Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore A meno di imprevisti.

10 A proposito di imprevisti Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile Le informazioni sull etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall estrazione Altre circostanze impreviste (es. Scheda all interno della confezione) McElroy, JID 2014 A proposito di imprevisti Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile Le informazioni sull etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall estrazione Altre circostanze impreviste (es. Scheda all interno della confezione) McElroy, JID 2014

11 Esami accessori per la conferma Il sequenziamento Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014 Anticorpi La ricerca degli anticorpi in genere ha valore di documentazione retrospettiva Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane) Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive

12 Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995) IgM IgG Ksiazek, JID 1999 Rivelazione della risposta umorale e cellulare specifica Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione. Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche. 24

13 Immunofluorescenza indiretta Negative control IgM positive sample IgG positive sample 25 Identificazione del virus Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4) e successiva caratterizzazione degli isolati con metodi immunologici o molecolari. In casi particolari èprevisto anche lo studio morfologico in Microscopia Elettronica,sia sull isolato che sul campione biologico iniziale. 26

14 Coltivazione del virus: BSL4 0 0< -15 BSL , BSL BSL4 Fase della malattia Tipologia di campioni Tipologia di contenitore Fase acuta sintomatica (Entro i primi 2-7 giorni dall esordio) Fase convalescente (risoluzione della sintomatologia, e comunque non prima di 15 giorni dall inizio della sintomatologia) Sangue con EDTA per RT-PCR Sangue senza anticoagulanti per sierologia Eventuali campioni biologici aggiuntivi: Urine Tamponi mucosali Altro Sangue con EDTA per RT-PCR Sangue senza anticoagulanti per sierologia Eventuali campioni biologici aggiuntivi: Urine Tamponi mucosali Altro Tipologia di campioni Provetta sterile infrangibile con EDTA Provetta sterile infrangibile Contenitore infrangibile sterile Tampone floccato in terreno di trasporto virale in flacone infrangibile Da concordare con il Laboratorio Provetta sterile infrangibile con EDTA Provetta sterile infrangibile Contenitore infrangibile sterile Tampone floccato in terreno di trasporto virale in flacone infrangibile Da concordare con il Laboratorio

15 Prima di inviare campioni, è necessario contattare il laboratorio. Il Laboratorio di Virologia è attivo h24. Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri: Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne. Ulteriori recapiti utili: Accettazione: tel ; fax Segreteria: fax Preparazione dei campioni.1 Il campione di scelta per la ricerca del virus èsangue- EDTA (no eparina) I campioni vanno mantenuti a +4 C prima dell invio Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro il piùbreve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e a temperatura refrigerata Per tempi di consegna piùprolungati, concordare con il Laboratorio le modalitàdi preparazione e conservazione

16 Preparazione dei campioni. 2 I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in tutte le sue parti Su ogni singolo campione deve essere apposta un etichetta riportante a chiare lettere il nome del paziente, la tipologia del campione (sangue, urine, altro) e la data di prelievo. Le informazioni riportate sulle provette devono essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati. Confezionamento e trasporto dei campioni Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo involucro Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico (Circolare Ministeriale n 3/2003 Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici ) x Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) Lazzaro Spallanzani, Roma L invio va concordato con il Laboratorio

17 L indirizzo cui inviare in campioni è: Laboratorio di Virologia Padiglione Baglivi Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L. Spallanzani Ingresso carrabile: via Giacomo Folchi, 6a Roma Consegna dei campioni Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso di sospetta infezione da virus Ebola

18 Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)