Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici

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1 "Focus su sicurezza d'uso e nutrizionale degli alimenti" Novembre 2005 Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici Simona Di Pasquale Pericoli microbiologici connessi agli alimenti

2 Nel corso degli anni, diverse metodiche sono state applicate all isolamento e all identificazione del virus enterici negli alimenti (molluschi, nelle acque e nei vegetali). La scelta del metodo è legata alla valutazione di diversi aspetti analitici: la concentrazione virale, la matrice alimentare, i tempi di determinazione e i costi. Al momento attuale, i metodi più utilizzati sono: le colture cellulari, le tecniche di biologia molecolare (sonde, PCR) e i sistemi integrati (colture cellulari-pcr)

3 Linee cellulari suscettibili (tecnica valida ai fini della sicurezza alimentare, perchè è in grado di mettere in evidenza l infettività virale. Talvolta necessita, di tempi lunghi, tali da renderli poco utili per l igienicità dei prodotti in esame. Metodi rapidi e innovativi - PCR - Real Time PCR.

4 REAL TIME PCR SYBR Green I sistemi di rilevamento Sonda Fluorescente R R Q

5 REAL TIME PCR Vantaggi La sensibilità La specificità Monitorare la reazione di PCR mentre questa si verifica e registrare l emissione della fluorescenza durante la reazione Permette di acquisire un dato quantitativo con un ampio range ( ) La rapidità di risposta

6 REAL TIME PCR Vantaggi Al termine della reazione di amplificazione non è richiesta nessuna manipolazione: elettroforesi blotting o il sequenziamento pertanto si ha una: diminuzuione dei tempi di analisi riduzione dei rischi di contaminazione ambientali Tale metodo, rappresenta quindi, un valido strumento applicabile sia al controllo delle derrate alimentari sia in estesi piani di monitoraggi necessari per la valutazione del rischio microbiologico.

7 Nell ambito del progetto: 6th European framework Development of standard reference methods for hepatitis A virus and Noroviruses in bivalves molluscan shellfish. SEAFOODPlus (Project 3.1 REFHEPA) l obiettivo è: definire e standardizzare metodi di Real Time PCR per la determinazione quantitativa del virus dell epatite A nei molluschi definire un controllo di processo per l estrazione dell HAV, mediante Real Time PCR definire un controllo interno dell amplificazione (IAC) - IAC ad RNA -IAC a DNA

8 Definire e standardizzare metodi di Real Time PCR per la determinazione quantitativa del virus dell epatite A nei molluschi Sono stati sviluppi di un metodi rapidi, riproducibili, sensibili e di facile esecuzione per la determinazione del virus dell epatite A in lisati cellulari e in molluschi, mediante una tecnica di Real-Time PCR, usando ABI Prisma TM 7700 System. Real Time PCR - SYBR Green Real Time PCR - Sonda Nested Real Time - PCR- Sonda

9 Materiali e metodi Ricerca dei Primers e della sonda per la determinazione dell HAV: allineamento delle sequenze dei virus presenti in banche dati internazionali e ricerca delle regioni genomiche maggiormente conservate. Ottimizzazione delle condizioni di Retrotrascrizione e di Real Time PCR Estrazione dell RNA virale da lisati cellulari e da estratti di mollusco contaminato sperimentalmente: - Soluzione D - Kit estrazione (NucleoSpin RNA II) Determinazione del limite di sensibilità mediante curva standard ottenuta correlando i valori di Ct e le concentrazioni scalari delle sospensioni virali.

10 Ottimizzazione dei parametri della RT e di PCR Analisi del valore di Ct Analisi della Curva di Melting (solo per la Real Time PCR SYBR Green)

11 Risultati Estrazione dell RNA virale da lisato cellulare con soluzione D Log. (Rel Time PCR - Sonda) Log. (Real Time PCR - SYBR Green) 40 Threshould cycle (Ct) y = -1,1717Ln(x) + 35,37 R 2 = 0,9892 y = -1,4184Ln(x) + 30,036 R 2 = 0, ,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 Starting quantitaty (TCID 50 )

12 Risultati Estrazione dell RNA virale da lisato cellulare con soluzione D Log. (Real Time PCR - Sonda) Log. (Real Time PCR SYBR Green) Log. (Real Time Nested - PCR - Sonda) TCID 50 (600 particelle virali) Threshould cycle (Ct) < 1 TCID 50 (< 60 particelle virali) 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 Starting quantitaty (TCID50)

13 Risultati Estrazione dell RNA virale da mollusco con soluzione D Log. (RT-nested PCR Probe (mussels)) Log. (RT-nested PCR probe (cell culture) Threshould cycle (Ct) y = -1,4184Ln(x) + 30,036 y = -1,0675Ln(x) + 37,622 R 2 = 0, R 2 = 0, ,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 Starting quantitaty (TCID50)

14 Risultati Nested Real Time PCR Sonda Estrazione dell RNA virale da mollusco con Kit e soluzione D Ct u PCR Virus sospension (kit) Virus sospension hepatopancreas (kit) Virus sospension (solution D) Virus sospension hepatopancreas (solution D) Lineare (Virus sospension hepatopancreas (solution D)) Lineare (Virus sospension (solution D) ) Lineare (Virus sospension hepatopancreas (kit) ) Lineare (Virus sospension (kit) )

15 Risultati Real Time PCR Sonda Estrazione dell RNA virale da lisato cellulare e da mollusco con Kit Ct Lisato cellulare Estratto di mollusco 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 Concentrazione

16 Conclusioni Real Time PCR - Sonda Ha un elevata specificità Migliorando il metodo di estrazione dell RNA virale si ha: maggior recupero dell RNA virale migliore riproducibilità nel recupero dell acido nucleico maggior linearità di risposta possibilità di avere un limite di sensibilità paragonabile al metodo Nested Real Time PCR Sonda riducendo la possibilità di falsi positivi

17 Real Time PCR - SYBR Green Conclusioni Ha un elevata sensibilità Può essere applicato ai protocolli sperimentali che sono già in uso per l esecuzione della PCR classica apportando solo piccole modifiche. Più di una molecola di SYBR Green si può legare alla doppia elica di cdna, in modo che, gli ampliconi prodotti generino un segnale molto intenso. Il SYBR Green si lega indiscriminatamente ad ogni doppio filamento di cdna, ma la specificità della reazione è determinata dall analisi della curva di melting (Tm) dell amplicone ottenuto.

18 Definire un controllo di processo per l estrazione dell HAV, mediante Real Time PCR Calicivirus Felino (FCV) impiegato come controllo di processo Scelta della sonda e di una coppia di primers Ottimizzazione dei parametri di RT e della Real Time PCR

19 Nell a mbito della collaborazione tra: il Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari - Pericoli Microbiologici Connessi agli alimenti e il Central Science Laboratory (CSL) -Food Microbiology di York (Inghilterra) l obiettivo è di: Definire un metodo di eluizione e concentrazione per la determina-zione di HAV e Norovirus nei vegetali e nelle acque minerali Definire un metodo di estrazione e purificazione dell RNA virale per la determinazione di HAV e Norovirus nei vegetali e nelle acque minerali. Determinare quantitativamente l HAV e i NoV nei vegetali e nelle acque minerali, mediante il metodo Real Time RT-PCR.

20 Grazie per l attenzione