Approcci metodologici nella microbiologia delle acque e criticità dei metodi analitici

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1 Approcci metodologici nella microbiologia delle acque e criticità dei metodi analitici Istituto Superiore di Sanità Roma 30 ottobre 2007 Rossella Briancesco

2 Metodi tradizionali spesso poco sensibili Metodi colturali Pre-arriccchimento Arricchimento Isolamento Identificazione e conferma sottostima del reale carico microbico Solo una percentuale molto bassa (< 1%) dei microrganismi presenti nell'ambiente acquatico è evidenziabile sui terreni di coltura

3 I microrganismi sottoposti a condizioni di stress ambientale possono: perdere la capacità di moltiplicarsi in laboratorio pur continuando a rimanere metabolicamente attivi stato vitale non coltivabile perdere la capacità di esprimere caratteristiche metaboliche (pur moltiplicandosi nei substrati colturali) Escherichia coli nelle acque: non fermentanti il lattosio ~ 10% non producono gas ~ 8% L. pneumophila Campylobacter Vibrio E. Coli O157:H7 Salmonella Shigella

4 Metodi colturali - Limiti Specificità Sensibilità Tempo di rilevamento Specificità e sensibilità Nutrienti non specifici alimentano sia microrganismi target sia microrganismi interferenti Falsi positivi Agenti e fattori selettivi (antibiotici, sali, temperatura) limitano la crescita della flora interferente ma interagiscono anche con i microrganismi target Falsi negativi

5 Tempo di rilevamento batteri indicatori patogeni batterici 24 ore 48 ore Metodi colturali - Limiti La scarsa selettività dei substrati colturali impone più prove di conferma e/o identificazione biochimica, sierologica degli isolati patogeni speciali, virus, parassiti I risultati delle analisi si ottengono solo dopo che l acqua è giunta ai consumatori ed è stata utilizzata rischio per la salute gg/sett

6 Metodi colturali Colture su substrati liquidi - Presenza/assenza - MPN Colture su substrati agarizzati (conteggio delle colonie) - Inclusione in agar - spatolamento su piastra - filtrazione su membrana I metodi MPN eseguiti su un numero elevato di repliche garantiscono un livello di precisione molto alto (es. MPN miniaturizzati: microplate, colilert)

7 Metodi colturali - Bassi costi VANTAGGI - Facilità di esecuzione - Risultati qualitativi e quantitativi - Possibile identificazione preliminare (subs. selettivi) - Rilevamento anche di cellule in basso numero in combinazione con tecniche di concentrazione (filtrazione) SVANTAGGI Lunga esecuzione Non tutti i microrganismi sono coltivabili Non sempre sono analizzabili grandi volumi di acqua I m.o. vitali ma non coltivabili non sono rilevabili A volte poco selettivi Non forniscono informazioni sull infettività del m.o. Rischio biologico per l operatore

8 Metodi standardizzati (ISO, CEN, IDF, AOAC) sono di norma metodi colturali tradizionali Direttive europee (98/83/CE, 2006/7/CE) stabiliscono l uso di metodi colturali tradizionali

9 Metodi rapidi Requisito essenziale fornire risultati nel più breve tempo possibile : risultato nello stesso giorno del prelievo Tempestive contromisure Gran parte elaborati per la determinazione degli indicatori di contaminazione fecale. Numerosi quelli colturali. Alcuni particolarmente veloci sono da considerare metodi di early warning. Risultati in ore, alcuni entro ore

10 METODI RAPIDI Sensibilità Specificità Requisiti Possibilità di distinguere tra organismi vivi e morti Caratteristiche economiche e gestionali: costi disponibilità dei reagenti particolari capacità dell analista particolare preparazione dei campioni disponibilità di apparecchiature facilità nella interpretazione dei risultati

11 METODI RAPIDI METODI COLTURALI (basati su attività enzimatiche) TEST IMMUNOLOGICI METODI MOLECOLARI

12 METODI RAPIDI METODI COLTURALI che sfruttano l attività metabolica di specifici enzimi cellulari dei batteri L uso di specifici substrati - per idrolisi enzimatica di cromofori o fluorofori - permette di selezionare i microrganismi ricercati senza ulteriori prove per la conferma dell appartenenza al genere o alla specie. Enzimi come β-d-galattosidasi, β-d-glucuronidasi, β-d-glucosidasi e amino-peptidasi sono quasi esclusivi dei batteri coliformi, di Escherichia coli, degli enterococchi e di Pseudomonas aeruginosa.

13 METODI COLTURALI che sfruttano attività enzimatiche Basati su : - filtrazione su membrana (substrati cromogeni) - MPN (colilert, microplates) - P/A (colifast) Es.: Colilert 18 Metodo ufficiale di riferimento per le analisi delle acque destinate al consumo umano (ISS A 001A rev. 00) Due nutrienti indicatori ONPG e MUG, vengono metabolizzati rispettivamente dai coliformi e da E. coli, con produzione di un composto giallo e di uno fluorescente.

14 METODI RAPIDI TEST IMMUNOLOGICI Tutti basati sulla specificità della reazione antigene -anticorpo. LA (latex agglutination) EIA (enzyme immunoassay) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) IFA (fluorescence immunoassay) IMS (Immunomagnetic separation)

15 TEST IMMUNOLOGICI: IFA Immunofluorescenza (Metodi analitici per i protozoi patogeni: ISS A 017A rev.00 e ISS A 017B rev.00) Singole cellule possono essere visualizzate al microscopio ad epifluorescenza grazie al legame con anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi (es. FITC), diretti contro epitopi di superfice degli organismi target. Non fornisce informazioni su vitalità e infettività; organismi autofluorescenti possono inficiare il riconoscimento. 10 µm 10 µm Cisti di Giardia Oocisti di Cryptosporidium

16 SEPARAZIONE IMMUNOMAGNETICA TEST IMMUNOLOGICI: IMS Tecnica di concentrazione e di purificazione. Utilizzata nella fase di chiarificazione del metodo di analisi dei protozoi Giardia e Cryptosporidium. Gli organismi target sono isolati da campioni concentrati di acqua mediante utilizzo di microsfere magnetiche coniugate con anticorpi monoclonali rivolti contro epitopi di superfice. Separazione specifica, recuperi elevati, facile esame microscopico sospensione finale.

17 Metodi molecolari METODI RAPIDI Obiettivo: rapida e sensibile ricerca dei m.o. mediante rilevamento diretto degli acidi nucleici elevata specificità elevata sensibilità bassa possibilità di falsi positivi (contaminazioni) remota possibilità di falsi negativi possibilità di identificare m.o. a crescita difficile e con profilo biochimico incerto!fondamentali PER INTERVENTI RAPIDI IN CASO DI SOSPETTO INQUINAMENTO DI ACQUEDOTTI O EVENTI EPIDEMICI

18 METODI RAPIDI Metodi molecolari Tecniche di Ibridazione restrizione amplificazione usate singolarmente o combinate

19 Tecniche di ibridazione Metodi molecolari Southern Bloth: utilizzata per la conferma di ceppi isolati ed identificati con metodi colturali Limiti: - cross-reaction (falsi positivi, scarsa specificità) - non è possibile differenziare tra m.o. vivi e morti Fluorescent In Situ Hybridation (FISH) Utilizzata: -studi di filogenesi dei batteri - e come test per l identificazione dei protozoi G e C insieme all IFA

20 FISH Specifiche sequenze nucleotidiche del m.o. target (rrna( rrna) vengono rilevate mediante ibridazione con sonde marcate a fluorescenza, dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule. Vantaggi Tecniche di ibridazione Limiti - Elevata specificità - Rapidità di esecuzione (2-3 ore) - Rileva anche i m.o. vitali non coltivabili - Elevata sensibilità se il target è RNA ribosomiale - Possibile ricerca simultanea di più m.o. - Possibile automazione mediante scanning del filtro -Scarsa sensibilità per i geni cromosomali o per mrna - E identificabile solo ciò che è tassonom. definito - La distinzione tra organismi vivi e morti è difficoltosa - Poco applicabile a campioni ambientali con scarso numero di cellule (segnale debole)

21 Tecniche di restrizione Metodi molecolari o di digestione enzimatica con endonucleasi di restrizione es: ribotipizzazione o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Metodica di tipizzazione genotipica, basata sull analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione dei geni codificanti gli RNA ribosomiali. Utilizzate solo su colture pure. Utili per differenziare differenti ceppi di una stessa specie

22 Tecniche di amplificazione Metodi molecolari PCR (Polymerase Chain Reaction) Reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un segmento specifico di DNA, ottenuta per mezzo di una DNA polimerasi a partire da una coppia di primers specifici.

23 PCR (Polymerase Chain Reaction) Tecniche di amplificazione Vantaggi Elevata sensibilità Elevata specificità Possibilità di identificare m.o. non coltivabili Rapidità (3 4 ore) Base di partenza per altre analisi Limiti Non è garantito il rilevamento di un singolo m.o. Occorre una quantità sufficiente di DNA del m.o. target Alcuni composti presenti nell ambiente sono inibitori La procedura di base non consente la quantificazione Nessuna informazione sulla vitalità Nessuna informazione sulla infettività

24 Tecniche di amplificazione PCR: quando? Ricerca di microrganismi non coltivabili,, o in fase VNC; Ricerca di microrganismi difficili da coltivare e con tempi analitici lunghi; Ricerca di microrganismi a concentrazioni molto basse; Ricerca di microrganismi privi di caratteristiche biochimiche e colturali tipiche; Ricerca di geni responsabili della virulenza in ceppi patogeni; Studi epidemiologici (sequenziamento dei prodotti della PCR).

25 Varie tipologie di PCR Tecniche di amplificazione PCR standard: il target di amplificazione è DNA RT- PCR: il target di amplificazione è RNA Nested PCR PCR: il prodotto di una prima reazione di amplificazione è utilizzato come templato per una seconda reazione di PCR Multiplex PCR: simultanea amplificazione di più sequenze target PCR Real-time time: PCR PCR quantificativa

26 Tecniche di amplificazione Metodi molecolari RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): il target di amplificazione è RNA che viene prima retrotrascritto in cdna e quindi amplificato. Vantaggi Gli stessi della PCR Indicazioni sulla vitalità Informazioni sulla virulenza Limiti - Gli stessi della PCR eccetto la discriminazione tra vivi e morti - Difficoltà nell estrazione di molecole di RNA intatte, data la loro instabilità Utilizzata ad es. nel metodo ISS A 17D rev. 00 per la stima della vitalità di cisti/oocisti di protozoi patogeni.

27 Real-time PCR Nella PCR real-time oltre alla coppia di primers specifici del microrganismo che si vuole ricercare, viene aggiunto al mix di reazione di PCR una sonda fluorescente che, legandosi al tratto compreso tra le estremità amplificate dai primers, permette di visualizzare il prodotto di amplificazione in tempo reale. La fluorescenza emessa durante l amplificazione viene misurata da una telecamera. Elevata specificità Elevata sensibilità Rapidità di esecuzione Dati quantitativi Ridotta possibilità di contaminazione post PCR

28 METODI MOLECOLARI Criticità Costi Strumentazione specialistica Elevata specializzazione del personale Standardizzazione delle procedure analitiche

29 GRAZIE PER L ATTENZIONE!