Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

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1 DNA

2 Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

3 Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

4 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

5 Enzimi di restrizione Enzimi provenienti da batteri Svolgono azione protettiva Degradano il DNA di virus Riconoscono specifiche sequenze di DNA Di regola riconoscono sequenze di 4-8 pb Premio Nobel 1978 (Arber, Nathans, Smith)

6 Enzimi di restrizione digestione con EcoRI G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G

7 Nome Bam HI Eco RI Hind III Nae I Pst I Sma I Batterio di prov. Bacillus amyloliquefaciens H Eschericia coli RY13 Haemophilus influenza Rd Nocardia aerocolonigenes Providencia stuartii Serratia marcescens Sito di ric. G GATCC G AATTC A AGCTT GCC GGC CTGCA G CCC GGG

8 Enzimi di restrizione Tagliano in DNA sempre nello stesso sito Utilizzo per creare frammenti di DNA Per inserire DNA estraneo nel genoma Produconi frammenti di DNA di prevedibili dimensioni

9 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

10 Elettroforesi su gel Separa i frammenti di DNA in base alla loro dimensione Utilizza un campo elettrico Il DNA è caricato negativamente La separazione avviene in una matrice di gel Permette la visualizzazione di frammenti di DNA

11 Elettroforesi su gel ds DNA Digestione con enzima di restrizione - direzione della migrazione +

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13 L enzima taglia il tratto di DNA di interesse in corrispondenza dei siti di restrizione( ): sul cromosoma normale (HbA), con il probe utilizzato, crea un frammento di 1.15 kb; sul cromosoma col gene mutato, poiché la mutazione comporta l abolizione del sito di restrizione intermedio, crea un frammento di 1.35 kb Applicazione diagnostica di frammento di restrizione

14 Applicazione diagnostica di frammento di restrizione

15 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

16 Ibridizzazione Una sequenza di DNA si appaia con una sequenza nucleotidica complementare Si denatura il DNA col calore (singola elica) Riducendo la temperatura le sequenze complementari si appaiano (re-annealing o ibridizzazione)

17 DNA in esame a singola elica Probe o sonda marcata

18 Sonda o probe (sequenza nota) sequenza DNA in esame DNAa singola esamelica La sonda di DNA (a singola elica) si lega (ibridizza) con la sequenza complementare se presente nel DNA in esame.

19 Per evidenziare l avvenuta ibridizzazione si utilizza la metodica del: Southern blotting (Ed Southern 1975) Trasferimento dei frammenti di DNA da un gel ad una membrana di nitrocellulosa Ibridizzazione con probe (sonda) di DNA radiomarcato Visualizzazione di specifici frammenti di DNA

20 Separazione frammenti in gel di agarosio Nitrocellulosa Carta da filtro Spugna Nitrocellulosa Gel Soluzione alcanina 1. DNA in esame 2. Digestione con enzimi di restrizione 3. Creazione di frammenti Ibridizzazione con probe radiomarcato Autoradiografia

21 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

22 La Polymerase Chain Reaction (PCR) La PCR è un potente strumento per amplificare il DNA, in milioni di copie, mediante la ripetizione della replicazione di una molecola stampo, in un breve periodo di tempo. Il processo utilizza sets di oligonucleotidi specifici (primers), sintetizzati in vitro, per innescare la sintesi di DNA. Il disegno dei primers (inneschi) dipende dalla sequenza del DNA che si vuole analizzare.

23 PCR La metodica è ripetuta per una serie di cicli (usualmente 20 50) durante i quali lo stampo di DNA viene sottoposto a denaturazione (alta temperatura) e sintesi di nuovo DNA sullo stampo (bassa temperatura) innescata dall azione guida dei primers sulle sequenze complementari di stampo mediata dalla DNA polimerasi in presenza di nucleotidi. DNA pol Il procedimento è stato automatizzato grazie all impiego di una polimerasi termostabile, la Taq polimerasi

24 PCR I prodotti della PCR sono poi analizzati mediante separazione su gel di agarosio seguito da colorazione con etidio bromuro e visualizzazione con transilluminatore a UV.

25 PCR

26 Tecniche di base Enzimi di di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

27 DNA sequencing automatizzato