PCR (Polymerase Chain Reaction)

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1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo enzimatico estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene

2 Sometime a good idea comes to yow when you are not looking for it Una buona idea nata inaspettatamente Kary Mullis La reazione è facile: non richiede altro che una provetta, pochi semplici reagenti ed una sorgente di calore

3 Il processo attraverso il quale vengono sintetizzate le nuove catene nucleotidiche avviene secondo le stesse modalità generali in tutti gli organismi viventi PROCESSO ENZIMATICO CATALIZZATO DALL ENZIMA DNA POLIMERASI: Sono gli stessi i meccanismi principali che stanno alla base della duplicazione dei procarioti e degli eucarioti datp + dgtp + dctp + dttp DNA Polimerasi 2 di molecole di DNA + 1 molecola di DNA Stampo a a doppia elica + PPi doppia elica

4 datp + dgtp + dctp + dttp DNA Polimerasi 2 di molecole di DNA + 1 molecola di DNA Stampo a a doppia elica + PPi doppia elica LA DUPLICAZIONE DEL DNA NECESSITA DI NUMEROSI ENZIMI E FATTORI PROTEICI ELICASI PRIMASI

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6 DNA Primers Polimerasi In natura tuttavia al processo della replicazione prendono parte tante altre proteine dntp

7 ELICASI

8 DNA Primers Polimerasi In natura tuttavia al processo della replicazione prendono parte tante altre proteine dntp

9 95 C 50 C

10 La DNA polimerasi catalizza la formazione dei legami fosfodiestere tra un nucleotide ed il successivo, percorrendo solo ed esclusivamente la direzione pertanto lo stampo che prenderà in considerazione per la replicazione avrà come orientamento il 3 5

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12 DNA Primers Polimerasi In natura gli enzimi alla temperatura di 95 C si denaturano dntp

13 DNA dntp Primers Taq (thermusaquaticus) Polimerasi In natura gli enzimi alla temperatura di 95 C si denaturano Attività catalitica alla temperatura di 72 C

14 Avendo a disposizione tutte queste nozioni e tutti i reattivi opportuni Kary si fece costruire uno strumento noto come termociclatore Questo indispensabile strumento possiede al suo interno una piastra riscaldabile nella quale vanno riposte le provette contenenti la miscela di reazione

15 Alla temperatura di 95 C la doppia elica del DNA si denatura Alla temperatura di circa 55 C i primers si legano alle regioni complementari sul DNA 5 5 Alla temperatura di C la polimerasi estende i nuovi filamenti di DNA L operatore è in grado di monitorare la variazione di temperatura impostando il file che ritiene più idoneo all esecuzione del suo esperimento

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17 Un normale ciclo di PCR prevede: 5 95 C // C C C // C Dai 35 ai 40 cicli

18 Il risultato di una reazione di amplificazione genica si può facilmente osservare elettroforeticamente Prodotto di PCR Marcatore di peso molecolare La messa a punto di una reazione d amplificazione Finora abbiamo parlato di condizioni genica di non amplificazione è né semplice standard né immediata

19 Fase di denaturazione La temperatura e la durata di questa fase dipendono da diversi fattori La composizione in basi del DNA La lunghezza del campione In generale un aumento della temperatura di denaturazione può essere necessario quando si vuol essere certi di denaturare completamente il DNA Bisogna comunque tener presente che temperature troppo elevate o mantenute troppo a lungo possono causare una drastica riduzione dell attività della polimerasica La qualità del DNA

20 Fase d ibridazione Rappresenta un punto cruciale della PCR, infatti, i primers devono ibridarsi in modo specifico e stabile sul DNA In poche parole si dovrà monitorare opportunamente Tempo Temperatura Per far sì che ciò avvenga è indispensabile adottare delle opportune condizioni dette di stringenza

21 La temperatura di ibridazione viene scelta quindi in base alla sequenza dei primers e si calcola mediante l applicazione di questa formula empirica T= 2X(A+T) + 4 X (G+C) dove A, T, C, G, indicano il numero dei nucleotidi presenti nel primer

22 Come ci dobbiamo comportare dunque nelle due diverse occasioni? Dall ibridazione dei primers dipende una buona percentuale di riuscita della PCR Il rischio in cui s incorre utilizzando, temperature eccessivamente elevate, al contrario, è quello di scoraggiare l ibridazione stessa Temperatura Se si mantengono temperature di ibridazione adottata più basse rispetto troppo a quella bassa teorica si rischia che i primers anche se specifici aumentare intercettino la temperatura altre regioni ridurre oltre il tempo quella d ibridazione che si auspica Temperatura adottata troppo elevata ridurre la temperatura

23 Fase di estensione E la fase meno delicata dell intero processo La temperatura di polimerizzazione corrisponde a quella ottimale per l enzima impiegato Per la Taq polimerasi sono consigliati 72 C Prodotto di PCR troppo carico In queste condizioni l enzima riesce ad incorporare 3550 nucleotidi al minuto 5 95 C // C C C // C Dai 35 ai 40 cicli

24 La riuscita di una buona PCR non dipende esclusivamente dall impostazione dei cicli di denaturazione, ibridazione ed estensione Tanti altri fattori entrano in gioco e questi fattori sono rappresentati dagli stessi reattivi usati

25 Campione biologico se si desidera che l amplificazione genica eseguita abbia un risultato ineccepibile, sarà molto importante prestare particolare attenzione alla preparazione del campione

26 Primers La lunghezza dei primers dovrebbe essere preferibilmente compresa fra le 20 e le 24 basi Il contenuto in G e C deve essere compreso tra il 45 ed il 50% G C G A T A T G C G C G C G A T A T G C G A T 5 3 Le estremità 3 dei primers non devono essere complementari per evitare la loro ibridazione 3 G C G C C G 5 3 A T G C G 5 G A T Nell esecuzione di una reazione di PCR la concentrazione ottimale per una coppia di primers è 1mM

27 dntp In una reazione di amplificazione la concentrazione di deossiribonucleotidi da utilizzare e 200 mm per ciascuno di essi Non si deve pensare che l aumento della loro concentrazione aumenti l efficienza di una PCR, al contrario una concentrazione superiore potrebbe aumentare la probabilità di errore da parte della DNA polimerasi, o a concentrazioni mm, addirittura inibirla.

28 DNA polimersi In una miscela di reazione di 100µl quantità da utilizzare è 2,5 unità Se il DNA stampo è molto complesso come il DNA genomico, la concentrazione ottimale è maggiore e può raggiungere le 4 unità Bisogna tuttavia tener presente che una concentrazione troppo alta potrebbe facilitare la formazione di prodotti aspecifici

29 Tampone All interno della cellula la DNA polimerasi lavora in determinate condizioni climatiche, cioè in determinate condizioni di ph ed in presenza di determinati ioni Useremo a tal fine un buffer contenente diversi sali e ad un determinato ph Tris cloruro 10 mm ph 8.3 a temperatura ambiente Cloruro di potassio KCl 50 mm Il cloruro di magnesio MgCl2 ad una concentrazione variabile generalmente 1,5 mm Il Ilnostro compito sarà quando quindi quello ricreare il suo diminuisce habitat all interno della ph della reazione viene di incubata a 72 C fino a 7.2 provetta nella quale dovrà agire

30 Obiettivo della esercitazione Verificare la eventuale presenza soia OGM a partire dai campioni di DNA estratto

31 Se una pianta è geneticamente modificata, il suo genoma contiene una sequenza aggiunta di DNA che è rintracciabile. Dunque, sfruttando la tecnica PCR possiamo amplificare e rilevare questo DNA. La PCR può essere applicata nelle sue due principali varianti: - la PCR qualitativa che rivela la presenza/assenza di OGM nel campione; - la PCR quantitativa che determina la percentuale di OGM nel campione stesso

32 La PCR qualitativa Verificare la eventuale presenza soia OGM a partire dai campioni di DNA estratto. nel genoma della soia sono presenti gli elementi della cassetta d espressione?

33 Cassetta d espressione Una volta identificato il gene da trasferire in un organismo ospite, è necessario innanzitutto preparare il costrutto o la cosiddetta cassetta di espressione, cioè una sequenza di DNA che contenga oltre al gene, il promotore inducibile ed il terminatore, ed inoltre i componenti necessari per la selezione delle cellule trasformate. GO STOP Promotore gene??? Gene reporter terminatore

34 Per il rilevamento della Soia OGM in laboratorio, andremo a rilevare la presenza di questo promotore Porzione di 204 bp

35 GO STOP

36 promotore Gene endogeno Il campione di soia viene inoltre sottoposto a PCR relativamente ad una sequenza genica altamente conservata nella specie vegetale che si sta analizzando, per valutare l efficienza l della PCR e l effettiva l estrazione di DNA vegetale Andremo a ricercare un tratto genico di 400 bp codificante per una proteina presente nel Fotosistema II

37 Esercitazione Ogni studente dovrà condurre due esperimenti di PCR.

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39 CaMV Gene endogeno Verrà ricercato contemporaneamente il promotore (CaMV), ed il gene endogeno (PSII)

40 Nella stessa provetta verranno inseriti i primers per il promotore CaMV ed i primers che delimitano il gene endogeno (plant PSII primers green).i primers utilizzati per le reazioni di PCR saranno pertanto: GMO primers (red) Plant PSII primers (green) Frammento di 204 bp Frammento di 455 bp

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42 Ad uno studente (Mauro) verrà fornito un campione di DNA di Soia che sappiamo essere modificata geneticamente Il DNA di soia OGM verrà sottoposto a PCR esattamente come tutti gli altri campioni di DNA di soia estratti precedentemente

43 I prodotti di amplificazione verranno sucessivamente controllati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide I profili che si dovrebbero poter visualizzare al termine dell elettroforesi sono: Frammento di 455 bp Frammento di 205 bp