Vettori di espressione

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1 Vettori di espressione Vengono usati per: 1.Generare sonde di RNA 2.Produrre la proteina codificata Per fare questo viene utilizzato un promotore che risiede sul vettore, modificato per ottimizzare l interazione con la RNA polimerasi RNA polimerasi di E. coli Forma base attiva (core) costituita da 2 subunità α, una subunità β e una subunità β Richiede la presenza del fattore σ (sigma) che conferisce specificità per il riconoscimento dei promotori Dominio amino-terminale Dominio carbossiterminale 1

2 Dominio carbossiterminale Dominio aminoterminale RNA polimerasi si deve legare a entrambe le regioni per iniziare la trascrizione La forza del promotore (n. molecole RNA prodotte da ogni RNA pol) dipende da: 1. quanto la sua sequenza si uniforma a quella consenso 2. distanza esistente tra 35 e 10 (17 pb è quella ottimale) 3. presenza di elementi al 5 (upstream) ricchi di A T che facilitano interazione della subunità α 2

3 Strategia per identificare sequenze promotrici Come scegliere il promotore Non è sufficiente scegliere il promotore più forte perché: - livello elevato di espressione continua =>drenaggio di energia e rallentamento della crescita - alcune proteine possono essere tossiche =>selezione dei mutanti che non producono la proteina E opportuno avere un promotore anche REGOLABILE 3

4 Promotori regolabili forti comunemente utilizzati lac trp tac o trc (ibrido) PL del batteriofago λ T7 (vettori pet) Tutti interagiscono con un repressore (i plasmidi contenenti tac, lac e T7 hanno anche una sequenza laco e il gene laci => inducibili con IPTG) Tutti vengono riconosciuti dal fattore σ della RNA pol batterica Operone lac 4

5 Catabolite Activator Protein 5

6 In assenza di glucoso, EIII trasferisce un gruppo fosfato alla adenilato ciclasi legata alla membrana. La adenilato ciclasi fosforilata catalizza la formazione di camp. camp lega CAP (CRP) e questo complesso attiva la trascrizione di una serie di geni che codificano enzimi che servono a compensare la mancanza del glucoso come fonte di carbonio 6

7 Effetti del glucosio, lattosio (o IPTG) e camp sul livello di trascrizione regolato dal promotore lac in E. coli * * camp è alto quando il glucosio nel terreno di coltura è basso 7

8 Regolazione del promotore trp Promotore trp RNA pol Complesso Triptofano-proteina repressore di trp Operatore X gene proteina repressore di trp Promotore trp RNA pol Operatore gene Controllo dell espressione genica utilizzando il promotore λp L ci Alternativamente si utilizza ci857 (mutante termosensibile) espresso costitutivamente Crescita dei batteri a C ci attivo assenza di trascrizione Induzione a 42 C ci inattivo trascrizione del gene 8

9 PROMOTORE T7 Regolazione della espressione di geni clonati in un vettore pet Espressione della Cloramfenicolo Acetil Transferasi (CAT) in E. coli ad opera di 3 promotori regolabili (valori espressi in µg/mg prot. tot.) λp L : Ottimi livelli di espressione e controllo trascrizionale trc: Promotore ibrido derivato dai promotori lac e trp. Inducibile con IPTG T7: Impiegato nei vettori di espressione pet 9

10 L efficacia con la quale si attiva la trascrizione dipende dalla proporzione tra proteina repressore e copie delle sequenze promotrici Troppe molecole di repressore: difficile indurre la trascrizione Troppo poche molecole di repressore: la trascrizione si verifica anche in assenza di induzione (i promotori perdono ) =>gene del repressore e il corrispondente promotore su 2 plasmidi diversi: Il repressore su un plasmide low copy (o su DNA cromosomiale) Promotore su plasmide high copy Esempio: come aumentare la produzione di proteine plasmide pkn402 Plasmidi/cellula Promotore PL NO pplc SI pcp SI Repressore ci termosensibile integrato nella cellula ospite Es: resa dell espressione DNA ligasi T4: 20% delle proteine cellulari 10

11 Produzione su larga scala Impianto pilota ( litri di coltura) Bioreattore industriale (>200 litri di coltura) Induzione chimica (IPTG) o tramite shift di temperatura possono essere costosi => L utilizzo del promotore PL regolato dal repressore ci indotto dal triptofano è una soluzione economica Sistema a 2 plasmidi Triptofano assente (- Triptone) Plasmide low copy Triptofano presente (+ Triptone) Plasmide low copy 11

12 Espressione in altri batteri gram-negativi Tutti i promotori sono attivi Il promotore tac è il più attivo in E. coli e il meno attivo negli altri batteri Il promotore Nm è penultimo in E. coli e il più attivo negli altri batteri => Il miglior promotore non è necessariamente quello che risulta più efficiente in E. coli Vettore di espressione universale per i batteri GRAM - Low copy Ampio spettro d ospite Tn5* *Trasposone 5: elemento genetico cromosomiale capace di spostarsi da una posizione all'altra del genoma p1 p2 70 bp Gene. 1988, 70(1): A novel vector allowing the expression of genes in a wide range of gram-negative bacteria. Kozlowski M, Van Brunschot A, Nash N, Davies RW. 12

13 Vettori per la preparazione IN VITRO di sonde a RNA Per produrre una sonda di RNA in vitro la sequenza genica viene clonata in un plasmide sotto il controllo di promotori fagici perché: 1. Sono promotori forti 2. Non sono riconosciuti da RNA pol di E. coli 3. Le RNA pol fagiche (T3, T7, SP6) sono semplici (composte da un singolo polipeptide) e facili da manipolare 13

14 Linearizzazione con AflII Linearizzazione con SpeI 14