Genetica dei microrganismi 3

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1 Genetica dei microrganismi 3

2 2 In questo caso il filtro poroso non eliminava lo scambio, indicando l esistenza di un fattore diffusibile DNasi resistente

3 Trasduzione generalizzata 3 Figura 10.14

4 4 Trasduzione generalizzata apple Durante la fase di impacchettamento del genoma virale nel capside, frammenti del cromosoma batterico vengono inseriti per errore. Una nucleasi può riconoscere siti pac simili a quelli fagici sul cromosoma batterico, dando origine alle particelle transducenti. La quantità di DNA trasportabile dipende dalla grandezza del capside (1% del genoma batterico corrispondente a circa 39kb con P22 di S. typhimurium, 2,5% del genoma batterico con P1 di E. coli, corrispondente a 90kb). Quando le particelle virali iniettano il DNA in un nuovo batterio, non sono in grado di determinare un infezione litica. Questo fago viene denominato particella trasducente generalizzata. Il DNA a doppia elica viene iniettato nella cellula e qui può integrarsi (trasferimento genico stabile), essere degradato oppure rimanere per un periodo nel citoplasma ed esprimersi. In questo ultimo caso si parla di trasduttanti abortivi e sono parzialmente diploidi. apple La trasduzione generalizzata può essere effettuata sia da fagi temperati che litici; in genere si usano mutanti int -, incapaci di entrare nello stato di profago, e HT, che riduce la specificità dell endonucleasi che agisce sul sito pac

5 5 Trasduzione specializzata: fago lambda L integrazione (attpxattb) e l excisione (attlxattr) di lambda dal cromosoma avvengono attraverso un processo di ricombinazione sito-specifica. L integrazione di lambda nel cromosoma è catalizzata dal prodotto del gene int (integrasi). L integrasi si lega a specifici siti del cromosoma del fago (attp) e del batterio (attb) e catalizza la ricombinazione tra questi siti. L excisione del profago lambda dal cromosoma richiede i prodotti genici di int e xis (excisionasi. Per l excisione, l integrasi e l excisionasi si legano a siti specifici a sinistra (attl) e a destra (attr) del profago e catalzzano la ricombinazione tra questi due siti. Sia l integrazione che l excisione richiedono i prodotti dei geni batterici hima e himd (IHF = integration host factor). Normalmente l integrazione e l excisione sono eventi efficienti e precisi.

6 6 Trasduzione specializzata: fago lambda attp attl attr attb attl attr

7 Formazione di un fago lambda trasducente λbio 7 apple Poiché il genoma di lambda è impacchettato con un meccanismo detto testa piena, i fagi trasducenti specializzati che portano piccole regioni del cromosoma batterico mancano della corrispondente quantità di DNA fagico. La porzione di DNA fagico mancante corrisponde alla parte opposta del genoma del profago. Fagi che portano i geni bio localizzati sulla parte destra del profago, mancheranno dei geni richiesti per le funzioni lisogene (es.. il gene int) che sono localizzati nella porzione sinistra del profago.

8 Formazione di un fago lambda trasducente λdgal 8 apple Fagi che portano i geni gal localizzati sulla parte sinistra del profago mancheranno dei geni richiesti per la funzione litica (es. i geni della coda) che sono localizzati nella parte destra del fago. apple I fagi dgal) sono efficienti per la lisogenia, ma deficienti per la lisi. Questi fagi, per portare a termine la lisi della cellula ospite, richiedono un fago helper (es. un fago lambda wild-type che fornisca le funzioni mancanti in trans), La lettera "d" scitta prima di gal indica che il fago è difettivo per la crescita litica.

9 Trasduzione specializzata 9 Mentre il fago normale ha il sito att completo, le particelle trasducenti difettive hanno un sito di integrazione ibrido non funzionale che ha origine in parte dal DNA batterico e in parte da quello del fago. Per questo motivo l integrazione del fago difettivo non avviene facilmente. Tuttavia, dei trasduttanti stabili possono derivare dalla ricombinazione tra il cromosoma del fago e quello del batterio in seguito a un doppio crossing-over su entrambi i lati del sito gal.

10 10 Formazione di lisati LFT e HFT Fagi trasducenti specializzati sono formati mediante un excisione aberrante di un profago lambda. Questo evento è molto raro se comparato alla normale excisione tra i siti attl e attr. L excisione aberrante avviene con una frequenza di 10-6 ed, in questo caso, si parla di "Low frequency transducing lysate" o LFT. Se questo fago trasducente specializzato coinfetta un nuovo ospite con un fago selvatico (fago helper), si otterrà un dilisogeno. L induzione di un dilisogeno a lisare, porterà ad un lisato contenente il 50% di fagi trasducenti specializzati e 50% di fagi wild-type. Questo lisato viene denominato un lisato ad alta frequenza di trasducenti ovvero "High frequency transducing lysate" or HFT.

11 11 Elementi trasponibili

12 12 Elementi trasponibili apple Elementi genetici mobili - si muovono da un luogo del genoma ad un altro. apple Trovati in tutti gli organismi studiati fino ad ora. apple Effetti: apple L inserimento vicino o entro un gene può determinarne l attivazione o l inattivazione. apple Possono causare delezioni, inversioni e traslocazioni del DNA. apple Possono portare a rotture del cromosoma.

13 Elementi trasponibili che si muovono attraverso intermedi a DNA apple Sequenze di inserzione batteriche: apple IS apple Sono lunghe da 700 a 1500 bp apple Hanno sequenze ripetute ed invertite alle estremità. apple Codificano per una trasposasi. apple Causano ripetizioni nel cromosoma dove si inseriscono. 13

14 Elementi trasponibili che si muovono attraverso intermedi a DNA 14 apple Trasposoni composti batterici: apple Hanno sequenze ripetute ed invertite alle estremità. apple Codificano per una trasposasi. apple Codificano per un marcatore di resistenza (es. resistenza ad un antibiotico).

15 Elementi trasponibili che si muovono attraverso intermedi a DNA 15 apple Trasposoni che mancano di ISs terminali: TnA family (Tn3) apple TnA family (Tn3): trasposasi + resolvasi Tn3 è come una grande IS

16 16 Elementi IS e trasposoni

17 17 Ricombinazione tra due sequenze vicine identiche (e.g trasposoni) porterà a riarrangiamenti apple Delezioni se le ripetizioni sono nello stesso orientamento apple Inversioni se le ripetizioni sono in orientamento opposto

18 18 Conseguenze della ricombinazione tra due trasposoni

19 19 Caratteristiche degli elementi Ty apple 1. Circa 35 copie per cellula (trasposoni di lievito) apple 2. Circa 340bp ad entrambe le estremità in orientamento diretto chiamate long terminal repeats or LTRs o elementi δ. apple 3. Somiglianza con i retrovirus eucariotici; poiché mancano di alcune funzioni retrovirali sono da considerare retrovirus primitivi a causa di questa somiglianza vengono chiamati retrotrasposoni apple 4. La trasposizione coinvolge un intermedio a RNA generato dalla trascrizione dell elemento Ty; una trascrittasi inversa fa una copia DNA dell elemento che è inserito in un nuovo sito del genoma. apple La frequenza di trasposizione è di 1/10 4 generazioni. apple Un importante differenza con i retrovirus è l assenza di particelle infettive (manca il gene env). Si formano comunque delle particelle simili a virus denominate VLPs (virus like particles)

20 20 La trasposizione di Ty coinvolge un intermedio a RNA

21 21 Confronto tra genoma retrovirali e retrotrasposoni Contrariamente ai virus, i trasposoni non hanno un ciclo vitale al di fuori dell ospite

22 22 trnamet PB: primer binding site

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24 Gli effetti degli elementi trasponibili dipendono dalla loro localizzazione 24

25 25 L inserzione di Ty in un promotore può aumentarne l espressione apple SPIEGAZIONE apple Le sequenze fiancheggianti degli elementi mobili contengono promotori forti. apple Questi aumentano l espressione genica fornendo segnali d inizio della trascrizione molto più efficaci e, qualche volta, in modo meno stringente.

26 26 Come viene regolata la velocità di trasposizione? apple I Ty sono di solito inseriti in regioni di eterocromatina trascrizionalmente inattive (Ty5) o nei promotori di trna (Ty3). apple L analisi della sequenza nucleotidica delle LTR di Ty5 ha messo in evidenza la presenza di sequenze simili a quelle presenti nei promotori dei geni di risposta ai feromoni (PRE). apple Effettivamente è stato dimostrato che in cellule trattate con il feromone, si ha un induzione della trascrizione di Ty5 e, analogamente, in cellule diploidi si ha una repressione dell espressione di Ty5. apple Questo tipo di risposta è stato messo in evidenza anche per altri Ty, ma non in tutti.

27 27 Qual è il significato biologico dei trasposoni? apple Fonte di mutazioni apple Ripetizioni vicine forniscono regioni per un crossing-over ineguale apple Gli elementi genetici mobili potrebbero essere alla base dell origine degli introni apple La ricombinazione tra introni di geni non correlati può determinare la formazione di nuove proteine (exon shuffling).