la struttura tridimensionale può essere ottenuta solo per Un intero dominio in genere da 50 a 300 residui

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1 Durante la traduzione l informazione di ripiegamento codificata nella sequenza aminoacidica diventa disponibile in maniera vettoriale la struttura tridimensionale può essere ottenuta solo per Un intero dominio in genere da 50 a 300 residui Sintesi di 300 residui in eucarioti richiede circa un minuto In questa frazione di tempo il dominio può aggregare Ambiente cellulare affollato in coli gr/l Utilità chaperoni che non aggiungono informazione conformazionale al ripiegamento ma evitano aggregazione e misfolding

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5 GroEL funziona solo congiuntamente al cofattore GroES ed è in grado di funzionare anche in vitro, ove è in grado di aumentare il rendimento di una proteina ripiegata. la peculiarità del sistema GroEL-GroEs è di permettere il folding in vitro di proteine che, in condizioni non permissive, non raggiungerebbero mai il loro stato nativo Suggerisce ruolo attivo in grado di sbloccare intermedi mal ripiegati

6 d = 45 A 57 kd h = 146 A H = 146 A de= 140 A di = 45 A A= 137 A

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8 Apicale Equatoriale=1-133, intermedio

9 Volume 85,000 A 3 Equatoriale Intermedio apicale Cambiamenti conformazionali coordinati che regolano Il legame e l idrolisi di ATP Siti di legame con proteina da ripiegare tra elica H e I

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11 Undici filamenti beta una forcina beta (6 7) Due filamenti ( 3 e 4) in loop mobile

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14 Ciclo 15 sec a 37 C I primi eventi avvengono indipendentemente dal secondo anello, mentre il passaggio finale, cioè il passaggio da R a T, è modulato anche dagli eventi che accadono nell anello trans.

15 Volume 85,000 A 3 contiene proteina di circa 30kDa Siti di legame con proteina da ripiegare tra elica H e I Non tutti e sette i siti sono necessari per il legame Stato T con la più alta affinità per SP È in grado di legare + del 50% di proteina di coli purchè siano in stato denaturato

16 Stato T alta affinità per SP La transizione da T a R è indotta dal legame con ATP La transizione è concertata Il legame di SP cerca di bloccare la conformazione nello stato T Criomicroscopia del complesso Groel-ATP mostra un rotazione oraria di apicale rispetto ad equatoriale Il legame di SP a Groel è indebolito dal Binding di ATP I binding sites si vengono a trovare in una Nuova posizione

17 Indebolimento Del legame

18 R= stato in cui SP è legato a Groel R = stato in cui SP è sequestrato all interno di Groel Il legame di Groes dipende dalla transizione T--- R ovvero la rotazione concertata del dominio apicale L inserimento dei loops mobile tra le eliche H ed I Induce un movimento più ampio del dominio apicale Introduzione di un blocco in un singolo dominio Impedisce la transizione R----- R Mutazioni hanno dimostrato che anche mutando 5 dei 7 siti di legame per Groes viene mantenuto il Complesso Groel-Groes

19 Perno Gly 410 conservata Pro 137 Volume 170,000 A 3 SP 58,000 dalton

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21 Legame di GroES dipende da transizione T---R docking dei loops Mobili tra elica H ed I accettate fino a 5 mutazioni

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23 Il volume interno diventa 170,000 A proteina di 58,000 kda Nello stato T gli SP binding sites sono distanti 25 A Nello stato R gli SP binding sites sono distanti 33 A La cavità è idrofilica il dominio trans è idrofobico

24 Il dominio trans non subisce grossi cambiamenti conformazionali

25 Il sito che lega l ATP è adesso schermato dal dominio intermedio e ASP 398 si coordina con Il Mg ed essenziale per l idrolisi di ATP L idrolisi è il meccanismo che Determina il tempo di Intrappolamento di SP

26 L idrolisi è quantizzata 7 ATP ed è un meccanismo che regola il Tempo di incapsulamento Fosfato inorganico lascia la cavità - ADP rimane legato Il segnale che destabilizza ADP avviene nell anello TRANS

27 Il legame di un altra SP nell anello trans avviene solo dopo l idrolisi di ATP Il legame di SP nell anello Trans non è sufficiente per il rilascio di ADP Il rilascio dei tre ligandi Groes, SP, ADP avviene quando ATP si lega all anello trans La velocità di rilascio aumenta se anche SP è legato in trans Prima è rilasciato GroES poi SP riduzione di volume il dominio intermedio si ritrae e ADP è rilasciato si ristabilisce l interno idrofobico Il domino per contrarsi ha bisogno che SP venga eliminata dalla cavità Nell anello trans l idrolisi di ATP inizia solo dopo che ADP è stato Rilasciato da anello cis

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34 Peptide 7 residui Interazioni idrofobiche Con catene laterali Legami idrogeno Con catena principale

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38 Disolfuro isomerasi Nel reticolo endoplasmatico Nei batteri nel periplasma Sito attivo in beta-alfa-beta Di filamenti 2 e 3 cysxxcysβ-α-β β-α-β s

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40 Prolil isomerasi Botte con otto filamenti Sito attivo esterno botte

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