Continua. Peptidasi H 2 O

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1 Continua Peptidasi H 2 O

2 Classificazione delle peptidasi 1. Meccanismo catalitico 2. Tipo di reazione catalizzata 3. Struttura molecolare e omologia

3 1. Meccanismo catalitico (mostrato per la chimotripsina) 1. Aspartato peptidasi (A) 2. Cisteina peptidasi (C) 3. Glutammato peptidasi (G) 4. Metallo peptidasi (M) 5. Serina peptidasi (S) 6. Treonina peptidasi (T) Questa classificazione, in realtà, ha molte limitazioni, in quanto i membri di ciascuna famiglia hanno strutture molecolari e meccanismi catalitici diversi.

4 2. Tipo di reazione catalizzata Tutte le peptidasi catalizzano la stessa reazione: idrolisi del legame peptidico. Quello che le rende diverse è : 1. la posizione del legame nella struttura primaria della proteina substrato; 2. la presenza di altri residui vicino al legame idrolizzabile; 3. altre caratteristiche

5 2.1 Endopeptidasi Endopeptidasi (EC ) Catalizzano l idrolisi del legame peptidico internamente alla catena, lontano da N- e C-terminale. Es.: Tripsina (S01.258) Nome MEROPS : tripsina 2, tipo A Chimotripsina (S01.001) Nome MEROPS : chimotripsina A (cattle-type) Pepsina (A01.001)- (Homo sapiens) Papaina (C01.001)- L attività proteolitica del lattice di papaia è nota fin dal 1880 (e.g. Martin, 1884). NH 2 COOH 1. Alcune endopeptidasi sono attive solo su piccoli substrati oligopeptidasi. 2. Le endopeptidasi iniziano la digestione delle proteine alimentari, generando nuovi N- e C-terminali che rappresenteranno il nuovo substrato per le esopeptidasi che completeranno il processo. Le endopeptidasi inoltre: 3. Rimuovono i peptidi segnale dalle proteine di secrezione; 4. Promuovono la maturazione di proteine precursore

6 2.2 Esopeptidasi Richiedono o un gruppo ammino-terminale o uno carbossi-terminale libero, o entrambi, e idrolizzano il legame a non più di tre residui di distanza dal gruppo terminale. Le esopeptidasi vengono ulteriormente suddivise in: 1. Amminopeptidasi 2. Carbossipeptidasi 3. Dipeptidil-peptidasi 4. Tripeptidil-peptidasi 5. Peptidil-dipeptidasi 6. Dipeptidasi

7 2.2.1 Amminopeptidasi Amminopeptidasi (EC ) NH 2 COOH Liberano un singolo residuo amminoacidico a partire dall N-terminale libero Carbossipeptidasi Carbossi peptidasi NH 2 COOH (EC ) Liberano un singolo residuo amminoacidico a partire dal C-terminale libero Dipeptidil-peptidasi Dipeptidil peptidasi NH 2 COOH (EC ) Liberano un dipeptide a partire dall N-terminale libero Tripeptidil-peptidasi Liberano un tripeptide a partire dall N-terminale libero Peptidil-dipeptidasi Peptidil dipeptidasi (EC ) NH 2 COOH Liberano un dipeptide a partire dal C-terminale libero Dipeptidasi Dipeptidasi (EC ) NH 2 COOH Liberano amminoacidi da un dipeptide e richiedono che sia il C- che l N-terminale siano liberi.

8 3. Struttura molecolare e omologia E il tipo di classificazione più recente perché dipende dalla disponibilità di informazioni circa la sequenza amminoacidica e la struttura tridimensionale delle proteasi, informazioni ottenute a partire dagli anni 90. Questo tipo di classificazione è quello adottato dal database MEROPS, che assegnata ogni peptidasi ad una FAMIGLIA sulla base delle omologie, raggruppa le famiglie in CLAN sulla base della stessa origine evolutiva (analoghe strutture terziarie, tipo di residui nel sito catalitico o motivi di sequenza comuni intorno al sito catalitico). FAMIGLIE: 1. Aspartato peptidasi (A) 2. Cisteina peptidasi (C) 3. Glutammato peptidasi (G) 4. Metallo peptidasi (M) 5. Serina peptidasi (S) 6. Treonina peptidasi (T) CLAN: Ogni clan si identifica con due lettere, di cui la prima rappresenta il tipo catalitico delle famiglie incluse nel clan. Alcune famiglie non possono ancora essere assegnate al clan, e, quando è richiesto, una famiglia viene descritta come appartenente al clan A-, C-, M-, S-, T- o U-, a seconda del tipo catalitico.

9 Cistein-proteasi Sono presenti in tutti gli organismi viventi. Sono state descritte più di 20 famiglie di cistein-proteasi (CP; EC ), molte delle quali hanno un importanza a livello industriale. Peso molecolare kda Esopeptidasi rompono il legame peptidico in prossimità dell N o del C-terminale Endopeptidasi rompono il legame peptidico lontano dall N o dal C-terminale. 5 CLAN : CA papaina-simili CB chimotripsina virale-simili CC endopeptidasi dei virus a RNA papaina-simili CD caspasi legumina-simili CE contenenti residui di His, Glu/Asp, Gln e Cys nel sito catalitico

10 Papaina La papaina (EC ) è la cistein-proteasi meglio conosciuta. E stata isolata nel 1879 dal frutto di Carica papaya ed è stata anche la prima proteasi per la quale è stata determinata la struttura cristallografica. 345 amminoacidi 3 ponti disolfurici interni peso molecolare 38.9 kda pi 8.75 due domini di dimensioni simili, con all interno il sito catalitico È formata da: - Peptide segnale (1-18) - Peptide di regolazione (19-133) - Sito attivo ( ) Massima attività: - ph T C

11 Il sito attivo della papaina è caratterizzato dalla presenza dei residui di Cys25 (Cys158 nell intera sequenza) e His159 (His 292 nell intera sequenza), situati ai lati opposti della tasca catalitica. Il residuo di Asn175 (Asp308 nell intera sequenza) è importante per l orientamento dell anello imidazolico dell istidina all interno del sito attivo. His 159 Asn 175

12 Il meccanismo catalitico richiede gruppo tiolico dell enzima nella forma ridotta (SH) e un ambiente acido. 1. Si forma un intermedio S- acetilato attraverso l attacco nucleofilo del gruppo tiolico della cisteina sul carbonio carbonilico del legame peptidico del substrato 2. Una molecola d acqua reagisce con l intermedio: il frammento N-terminale viene rilasciato e viene rigenerato l enzima per un nuovo ciclo catalitico.

13 I siti dell enzima S2, S1 e S1 (in blue in figura) sono importanti per il legame sia con la catena amminoacidica che con le catene laterali, mentre i siti S3 e S2 sono cruciali solo per il legame R con le catene laterali. C=O Le papaine mostrano una preferenza OH per i substrati che presentano un amminoacido idrofobico in posizione P2 (Phe, Leu, Ile, ecc.), mentre il residuo in posizione P1 non influenza in maniera determinante il legame enzima-substrato (anche se c è una preferenza H H per gli amminoacidi basici O quali Arg e Lys). Phe Leu Ile Arg Lys H 2 O Nomenclatura di Schechter e Berger Papaina

14 Bromelina E una proteina glicosilata estratta dal frutto dell ananas (Ananas comosus). Ficina Viene estratta dal frutto da varie specie di fico (Ficus glabrata, F. carica, F. elastica). Catepsine Le catepsine sono enzimi presenti nei tessuti animali all interno dei lisosomi. Sono importanti per molti processi fisiologici, quali la degradazione delle proteine cellulari.

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