Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 7

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 7

2 La struttura delle proteine Concetti chiave: La struttura terziaria di una proteina descrive il ripiegamentodei suoi elementi strutturali secondari e specifica la posizione nello spazio di ogni atomo della molecola inclusi quelli delle catene laterali. I residui non polari si trovano all'interno delle proteine, mentre i residui polari sono principalmente localizzati all'esterno. La struttura terziaria di una proteina ècostituita da elementi della struttura secondaria che si combinano formando motivi e domini. La struttura di una proteina èstata maggiormente conservata nel tempo rispetto alla sua sequenza. Alcune proteine contengono subunitàmultiple (struttura quaternaria) solitamente disposte in modo simmetrico.

3 STRUTTURA TERZIARIA La struttura terziaria rappresenta un livello di organizzazione superiore e si riferisce all organizzazione nello spazio della catena proteica nella sua completezza, comprendendo cioè sia le regioni di catena ordinate in strutture periodiche che quelle prive di regolarità, e si definiscono le forze che collegano queste regioni in un unica architettura. In pratica, la struttura terziaria definisce le coordinate spaziali di tutti gli atomi del polipeptide. Carbossipeptidasi A PDBid 3CPA

4 Distribuzione delle catene laterali nel citocromo c La localizzazione delle catene laterali varia in base alla polarità Residui idrofilici Residui idrofobici

5 STRUTTURA TERZIARIA Il termine struttura terziaria riguarda in genere le proteine globulari, dato che la costruzione di una proteina fibrosa prevede lo sviluppo preferenziale della struttura in una sola dimensione nello spazio realizzandosi mediante la ripetizione regolare di un certo motivo strutturale.

6 Le strutture supersecondarie: i motivi strutturali Le proteine globulari sono costituite da combinazioni di più segmenti di catena ordinati in strutture secondarie (motivi) particolarmente frequenti nella proteine. Tra queste, quelle più frequenti sono: Motivo βαβ: un α elica unisce due filamenti paralleli di un foglietto β Forcina β: filamenti antiparalleli connessi da ripiegamenti inversi Motivo αα: due α eliche antiparallele in successione Motivo βαβ Forcina β Forcina β Motivo αα

7 Le strutture supersecondarie: i motivi strutturali Motivo a chiave greca: una forcina β si ripiega per dare origine ad un foglietto β antiparallelo a quattro catene

8 La classificazione delle proteine: le proteine delle classi α, β e α/β Citocromo b562 PDBid 256B Frammento di immunoglobulina umana PDBid 7FAB Lattato deidrogenasi di pescecane PDBid 6LDH

9 Proteine della classe α

10 Proteine della classe β

11 Proteine della classe αβ

12 Topologia delle proteine: i barili βa 8 filamenti Proteina che lega il retinolo umana PDBid 1RBP Peptide-N 4 -(N-acetil-β-D-glucosamminil) asparagina amidasi PDBid 1PNG Trioso fosfato isomerasi PDBid 1TIM

13 Domini I motivi generalmente si combinano a formare strutture globularicompatte, chiamate domini. Una proteina può essere costituita da uno o più domini. I domini sono definiti come una catena polipeptidica o parte di essa che si ripiega indipendentemente in una struttura stabile. I domini possono essere strutturali o funzionali. Le proteine globulari risultano spesso costituite di più domini strutturali, regioni tridimensionali della proteina dotate di autonomia strutturale, nel senso che la loro struttura si definisce autonomamente rispetto al resto della proteina. I domini funzionali sono entità funzionali autonome alle quali competono funzioni specifiche della proteina.

14 Una proteina a due domini: la GAPDH Le catene polipeptidiche possono ripiegarsi in due o più strutture globulari che conferiscono alle molecole un aspetto plurilobato. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi PDBid 1GD1

15 Una proteina con quattro domini funzionali: il Fattore IX

16 La struttura delle proteine Concetti chiave: La cristallografia a raggi X e la spettroscopia NMR sono utilizzate per stabilire la posizione degli atomi nelle proteine. La struttura di una proteina èstata maggiormente conservata nel tempo rispetto alla sua sequenza. Nelle banche dati bioinformatiche sono depositate le coordinatedelle strutture macromolecolari. I programmi informatici rendono possibile la visualizzazione delle proteine e la comparazione delle loro caratteristiche strutturali.

17 Cristallografia a raggi X La cristallografia a raggi X è una tecnica che permette di determinare la struttura tridimensionale delle proteine. Le lunghezze d onda dei raggi X e le distanze tra gli atomi nei legami covalenti sono in entrambi i casi di 1.5 Å. Azzurrina Pseudomonas aeruginosa Flavodossina Desulfovibrio vulgaris Rubredossina Clostridium pasteurianum

18 Cristallografia a raggi X Il cristallo della molecola viene esposto al fasci di raggi X e lo schema di diffrazione risultante dalle posizioni degli atomi che si ripetono in modo regolare nel cristallo viene registrato. Le intensità dei massimi di diffrazione (macchie scure) sono impiegate per costruire attraverso funzioni matematiche un immagine della struttura 3D della struttura del cristallo. Fotografia di diffrazione ai raggi X della mioglobina

19 Cristallografia a raggi X I raggi X interagiscono quasi esclusivamente con gli elettroni. Si ottiene dunque una mappa di densità elettronica dell oggetto in studio.

20 Cristallografia a raggi X Una mappa di densità elettronica deve essere interpretata in termini di posizione dei suoi atomi. L accuratezza della determinazione dipende dal limite di risoluzione del cristallo. La struttura primaria della proteina deve essere nota consentendo di adattare la sequenza dei residui amminoacidici sulla mappa di densità elettronica. Mappe di densità elettronica della dichetopiperazina Una risoluzione maggiore migliora la qualità della mappa di densità elettronica

21 Risonanza magnetica nucleare L NMR si basa sull osservazione che un protone posto in un campo magnetico risuona in modo sensibile all ambiente elettronico vicino e alle interazioni con i nuclei che lo circondano. La spettroscopia per effetto nucleare Overhauser (NOESY) è in grado di stabilire le distanze interatomiche tra protoni anche distanti nella sequenza proteica ma con localizzazione spaziale ravvicinata nello spazio

22 Risonanza magnetica nucleare Poiché le misurazioni delle distanze interatomiche sono imprecise non è possibile dedurre una struttura unica ma un insieme di strutture strettamente correlate.

23 La struttura è più conservata della sequenza amminoacidica Proteine con sequenze conservate adottano analoghe conformazioni dello scheletro covalente. I citocromi c (trasportatori di elettroni) di specie eucariotiche differenti hanno sequenza e struttura 3D altamente conservata. I citocromi tipo c dei procarioti svolgono la stessa funzione e, pur mostrando un basso grado di omologia di sequenza, hanno conformazioni ai raggi X sono chiaramente affini. Nel corso dell evoluzione sono stati preferenzialmente conservati gli elementi strutturali e funzionali essenziali delle proteine più che la loro sequenza amminoacidica.

24 Gli strumenti bioinformatici di Internet

25 Struttura quaternaria Quando una proteina risulta costituita da più catene polipeptidiche (proteine oligomeriche), l organizzazione nello spazio di queste catene, dette subunità, rappresenta un ulteriore livello di complessità strutturale cui si dà il nome di struttura quaternaria. Le unità identiche di una proteina oligomerica (protomeri) possono essere assimilati ai domini strutturali di una proteina monomerica. Le forze che mantengono un struttura quaternaria sono le stesse che stabilizzano la struttura terziaria delle proteine.

26 Struttura quaternaria Deossiemoglobina PDBid 2DHB

27 Vantaggi della struttura quaternaria Le proteine costituite da protomeri identici rappresentano un risparmio in termini di materiale genomicoda impegnare nella programmazione di grosse strutture proteiche. La disponibilità di oligomeri costituiti di subunità identiche consente di regolare finemente la loro funzione biologica (es. attività catalitica) mediante interazioni specifiche tra le subunità. Le proteine costituite da subunità diverse offrono il vantaggio di integrare più funzioni diverse in un unica struttura proteica. La disponibilità nel genoma di un organismo superiore di geni codificanti vari tipi di subunitàdiverse di uno stesso enzima oligomerico, consente all organismo di esprimere nei vari tessuti e organi il tipo di subunità di volta in volta più adatto, modulando l attività dell enzima e adattandola alle diverse necessità. Tali oligomeri sono detti isoenzimi (es. Lattato Deidrogenasi).

28 Vantaggi della struttura quaternaria: la lattato deidrogenasi La lattato deidrogenasi è un tetramero cioè un oligomero formato da quattro protomeriche può costruirsi con due tipi di subunità: H (Heart) ed M (Muscle) per dare cinque forme tetrameriche H4, H3M, H2M2, HM3, M4. Tale enzima catalizza l interconversione tra lattato e piruvato: H H H H H H H H H M M M M M H M M M M M Nel tessuto muscolare predomina l isoenzima M4 che, avendo maggiore affinità per il piruvato, catalizza di preferenza la reazione nella direzione piruvato lattato. Nel cuore predomina l isoenzima H4, con affinitàmaggiore per il lattato e catalizza la reazione nella direzione lattato piruvato.

29 La struttura delle proteine Concetti chiave: La stabilitàdelle proteine dipende principalmente dagli effetti idrofobici e, secondariamente, dalle interazioni elettrostatiche. Le strutture delle proteine sono flessibili e possono comprendere regioni non ripiegate.

30 Stabilità ed effetto idrofobico Le strutture delle proteine sono stabilizzate in primo luogo dagli effetti idrofobici. I residui polari sono quasi tutti disposti sulla superficie del globulo proteico, mentre quelli apolari puntano quasi tutti verso l interno, a costituire quello che viene chiamato nucleo idrofobicodella proteina.

31 IL SISTEMA PROTEINA-SOLVENTE L effetto idrofobico fa sì che le sostanze apolari riducano al minimo i loro contatti con l acqua e rappresenta l elemento preponderante nella stabilità della struttura nativa di una proteina. L aggregazione delle catene laterali apolari all interno della proteina è favorita dall incremento di entropia delle molecole di acqua che altrimenti formerebbero gabbie ordinate intorno ai gruppi idrofobici.

32 Grafico dell'indice idropatico del chimotripsinogeno di bovino Un indice idropatico positivo denota una regione idrofobica (regioni interne della proteina) del polipeptide mentre un valore negativodenota una zona idrofilica(zone esterne della proteina).

33 La struttura delle proteine è stabilizzata da diverse forze La struttura terziaria di una proteina è tenuta insieme da: FORZE NON COVALENTI: LEGAMI A IDROGENO, INTERAZIONI IDROFOBICHE, FORZE DI VAN DER WAALS, LEGAMI IONICI FORZE COVALENTI: PONTI DISOLFURICI TRA CISTEINE ANCHE LONTANE NELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA

34 Appaiamenti ionici nell'emoglobina

35 STRUTTURA TERZIARIA I PONTI DISOLFURICI SI FORMANO PER OSSIDAZIONE DELLE CATENE LATERALI DI DUE CISTEINE Ribonucleasi A pancreatica

36 Tascheidrofobiche Residui polari possono essere presenti all interno di una proteina e stabilire ponti a idrogeno. E anche frequente che la superficie di una proteina globulare si ripieghi in alcuni punti, generando fessure o cavità ricche di residui apolari formando le tasche idrofobiche che rispondono a precise esigenze funzionali (es. siti catalitici degli enzimi).