Relazione struttura-funzione

Transcript

1 Biotecnologie applicate alla progettazione e sviluppo di molecole biologicamente attive A.A Modulo di Biologia Strutturale Relazione struttura-funzione Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Riconoscimento e complememtarità le funzioni di tutte le proteine dipendono dalla loro capacità di legare altre molecole (complesso proteina-ligando) ligando piccola molecola macromolecola legame di solito non covalente ed altamente specifico specificità dovuta a complementarità: - di forma - di distribuzione di carica - di donatori/accettori di legami a H cambiamenti conformazionali nella proteina possono accompagnare o essere necessari - per favorire il legame oppure - per impedire o sfavorire il legame

3 Riconoscimento e complememtarità siti di legame del ligando come unica funzionehanno il riconoscimento molecolare siti attivi favoriscono la catalisi in entrambi i casi tasche o fenditure sulla superficie proteica o cavità interne creazione di un microambiente anche molto diverso dalla soluzione che circonda la proteina Esempi: 1) cavità idrofobica simile a solvente organico capacità di legare lipidi 2) cavità ricca di residui carichi forte campo elettrostatico locale se le cariche sono negative sito di legame ioni + come Ca 2+ l accumulo di cariche simili in un sito (poche interazioni non favorevoli energeticamente) è compensato dalle interazioni favorevoli nel resto della struttura proteica

4 Riconoscimento e complememtarità 3) catalisi acido-base trasferimento di protoni da donatori ad accettori del substrato e delle catene laterali proteiche all interno del sito attivo il trasferimento può essere favorito da microambienti specializzati: Infatti: a) forte campo elettrostatico in cui catene laterali acide e basiche sono vicine ma non possono formare ponti salini come in soluzione acquosa a ph neutro residui Asp, Glu, Lys interagiscono col substrato o cofattore ma non fra loro b) alterazione della affinità per i protoni dei gruppi funzionali nel sito attivo 2 residui basici vicini sono entrambi meno affini ai protoni una base in un ambiente idrofobico abbassa la sua affinità per H + (rimarrà non protonata a ph neutro più reattiva) stessa cosa in senso inverso per le catene laterali acide

5 Le proteine sono molecole flessibili Flessibilità delle proteine le forze che mantengono i fold secondari e terziari sono deboli quando interazioni deboli vengono rotte i gruppi rilasciati possono formare nuove interazioni di energia equivalente moti interni classificati rispetto alla struttura media della proteina Da a Da a 10-3 Da 10-9 a 10-3 moti veloci fluttuazioni atomiche (es: vibrazioni interatomiche e rotazioni gruppi metile) moti di media velocità moti collettivi di gruppi di atomi (catene laterali o loop) moti lenti cambiamenti conformazionali su larga scala (movimenti di domini)

6 Le proteine sono molecole flessibili a T fisiologica le posizioni degli atomi proteici fluttuano attorno al loro valor medio con escursioni a) <1Å se nella parte interna della proteina (strettamente impaccata) b) >1Å se nella parte esterna della proteina (più vicina alla superficie ed in contatto col solvente) la struttura covalente del polimero impone limiti ai movimenti degli atomi e dei gruppi di atomi Esempio (movimenti collettivi di atomi): Flessibilità delle proteine 1) gruppi metile rotazioni su scala di tempi dei ps se un gruppo metile è vicino ad un gruppo metile nel core di una proteina i loro movimenti sono correlati per evitare collisioni steriche 2) catene laterali aromatiche rotazione su scala di tempi dei ps le rotazioni sono però poco frequenti, 1 ogni ~10 9 ps residui aromatici solitamente nel core proteico bassa probabilità di movimento concertato degli atomi adiacenti

7 Fluttuazioni locali Flessibilità delle proteine domini ripiegati correttamente non sono sottoposti a grosse distorsioni termiche a T ordinarie transizioni da un tipo di folding ad un altro sono osservate raramente, tranne nei casi patologici (transizioni struttura alfa a beta in proteine amiloidi e prioniche) a T fisiologiche alcune proteine possono alternare stati conformazionali distinti separati da una barriera di energia libera. In alcuni casi solo una delle conformazioni alternative è quella biologicamente attiva Esempio: equilibrio stati conformazionali distinti Lisozima del fago T4 2 domini collegati da cerniera stati conformazionali aperto e chiuso in equilibrio fra loro in soluzione

8 l associazione di ligandi può indurre: Fluttuazioni locali Flessibilità delle proteine a) ordine in segmenti peptidici disordinati (meno frequentemente può indurre disordine) b) riarrangiamento di una o poche catene laterali c) spostamenti di interi domini d) associazione e dissociazione di subunità (alterazione della struttura quaternaria) Esempio (c): movimento tipo coperchio Trioso fosfato isomerasi legame substrato/inibitore movimento a corpo rigido di 10Å di loop (8 residui) da aperto a chiuso che protegge il substrato dal solvente

9 Fluttuazioni locali i loop mobili non alterano la loro conformazione interna e si muovono come corpi rigidi su 2 cerniere. Possono a) agire come semplici cancelli per il legame di ligandi Flessibilità delle proteine b) anche fornire interazioni che stabilizzano il complesso (ruolo chiave in molti enzimi)

10 Flessibilità delle proteine Cambiamenti conformazionali indotti Esempio (c): movimento di domini Aspartato amminotrasferasi il legame del substrato induce il movimento del dominio più piccolo verso una nuova posizione in cui il sito attivo è più chiuso (rotazione di 10 ed avvicinamento >5Å) ponte salino fra Arg del dominio mobile e l alfa carbossilato dell aspartato legato questo induce il corretto posizionamento di residui fondamentali per la catalisi fit (o adattamento) indotto

11 Flessibilità delle proteine Adattamento delle proteine ai ligandi interazione proteina-ligando sito di legame in cui (a) la stereochimica (b) la configurazione di carica (c) i gruppi che possono formare legami a H siano complementari con quelli del ligando più di un ligando talvolta si adatterà a un sito di legame proteico, molti altri non si adatteranno e di solito solo il ligando produrrà la funzione biologica giusta modello classico rigido chiave-serratura modello adattamento indotto in cui sia proteina che ligando sono flessibili: durante il processo di legame ciascuna molecola può adattare la propria struttura in presenza dell altra

12 Flessibilità delle proteine Modello chiave-serratura siti di legame pre-strutturati, complementarità fra sito attivo enzima e substrato e nessun cambio conformazionale dovuto al legame del substrato Modello dell adattamento indotto siti di legame pre-strutturati, ma cambi conformazionali dovuti al legame del substrato

13 Flessibilità delle proteine Modello dell adattamento indotto protein chinasi A legata ad un peptide analogo del substrato stretta corrispondenza strutturale raggiunta attraverso reciproco adattamento

14 Flessibilità delle proteine Adattamento delle proteine ai ligandi Esempio: D-gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) enzima di lievito (mesofilo) vs enzima da Thermotoga maritima (termofilo estremo) attività specifica in funzione della temperatura - enzima di lievito: aumento attività specifica fino a ~35 C, poi denaturazione - enzima di estremofilo: aumento attività specifica e nessuna denaturazione per fino a oltre 70 C, ma attività inferiore rispetto al mesofilo a T ambiente

15 Flessibilità delle proteine Adattamento delle proteine ai ligandi Esempio: D-gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) l enzima estremofilo è più rigido a T ambiente rispetto al mesofilo diminuzione della funzione l enzima mesofilo è troppo flessibile ad alte T rispetto al termofilo diminuzione della funzione (stesso fenomeno per aggiunta di piccole quantità di agenti denaturanti (urea o SDS) non tutte le proteine sono flessibili allo stesso modo le proteine extracellulari presentano caratteristiche di maggiore rigidità (per migliorare la sopravvivenza nell ambiente ostile fuori dalla cellula)

16 Siti di legami proteina-piccolo ligando riconoscimento specifico di piccolo ligando da parte di una proteina ligando: substrati, cofattori, effettori allosterici i siti di legame di piccoli ligandi spesso possono essere identificati nelle proteine anche in assenza di ligandi (ricerca cavità interne di dimensioni e polarità idonee) legame in (1) depressioni della superficie proteica (2) siti sepolti all interno della matrice proteica Interazioni proteine-piccoli ligandi (1) tasche di legame profonde e cavità possono: (a) avvolgere completamente il ligando utilizzando la complementarità di forme per fornire specificità (b) creare microambienti inusuali (c) impedire l accesso di acqua (2) diffusione dei ligandi attraverso la matrice proteica (a) flessibilità strutturale delle proteine (b) stati conformazionali aperti/chiusi (stato aperto legame ligando stato chiuso) (c) presenza di tunnel

17 Interazioni proteine-piccoli ligandi Siti di legami per piccoli ligandi i siti attivi degli enzimi (siti catalitici) ed i siti di legame di molti recettori di piccole molecole si trovano sulla superficie proteica in posizioni prevedibili sulla base della struttura se presenti più domini strutturali o più subunità, tali siti sono spesso localizzati all interfaccia dei domini o delle subunità (o entrambi) 3-isopropilmalato deidrogenasi (dimero) sito di legame del cofattore NADPH all interfaccia fra 2 domini e fra 2 subunità

18 Interazioni proteine-piccoli ligandi Siti di legami per piccoli ligandi i siti di legame di ligandi sulle superfici proteiche si distinguono spesso per una quantità superiore alla media di superficie idrofobica esposta al solvente tali siti idrofobici non portano alla oligomerizzazione della proteina perché troppo piccoli e/o troppo concavi combinazione fra alto grado di concavità + superficie idrofobica esposta alta probabilità di sito di legame superficiale per piccolo ligando residui apolari eme residui carichi + lipide oleato legato a proteina trasportatrice di lipidi nsltp citocromo c6 l affinità tra una proteina ed il suo ligando è principalmente dovuta a interazioni idrofobiche (che sono non direzionali) la specificità di legame è principalmente dovuta a forze anisotrope (o direzionali), come i legami a H

19 Interazioni fra macromolecole Siti di legami macromolecola-macromolecola riconoscimento specifico di una macromolecola da parte di una proteina interazioni distribuite su ampia area superficiale contigua ( 100Å 2 ) interazioni distribuite su diverse regioni di legame separate molti punti di contatto che contribuiscono all energia di legame i siti di interazione possono essere localizzati ovunque sulla superficie delle macromolecole difficile predizione accurata dei siti di interazione solo sulla base della struttura (o del modello teorico) delle macromolecole spesso diversa struttura in presenza o assenza di ligandi

20 Siti di legami macromolecola-macromolecola siti di legame più frequenti: Interazioni fra macromolecole (a) anse localizzate in superficie (b) ampie cavità localizzate in superficie } specifica complementarità di forma (c) per interazioni proteina-dna/rna anse della proteina che protrudono o eliche che si adattano ai solchi maggiori e minori dell acido nucleico In generale: ampie aree idrofobiche superficiali promuovono e stabilizzano lo stato oligomerico di proteine

21 Interazioni fra macromolecole Siti di legami fra macromolecole 2 complessi proteina-dna motivo elica-turn-elica che si lega nel solco maggiore del DNA ormone umano della crescita in complesso con 2 molecole del suo recettore stretta corrispondenza strutturale ansa della catena proteica che si lega nel solco maggiore del DNA

22 Interazioni fra macromolecole Scambio di partner e scambio di domini interazioni proteina-proteina transienti sono indotte dalla presenza di zone superficiali più piccole e meno idrofobiche rispetto a quelle di oligomerizzazione interazioni transienti, poche e deboli, create e rotte in qualsiasi istante necessità dei partner di poter esistere nell ambiente acquoso cellulare in modo indipendente capacità di associarsi dinamicamente con partners diversi ( scambio di partner ) Es: proteine coinvolte nei cammini di trasduzione del segnale scambio di domini Es: proteine capsidi virali, proteine coinvolte nei cammini di trasduzione del segnale

23 Interazioni fra macromolecole Scambio di partner e scambio di domini Esempio: proteine coinvolte nei cammini di trasduzione del segnale (STAT) - molti ormoni, fattori di crescita ed immunoregolatori inviano segnali al nucleo attraverso le molecole STAT (trasduttore del segnale ed attivatore della trascrizione) - il dominio SH2 di STAT si lega alla fosfotyr presente sulle code del recettore (recettore fosforilato da chinasi JAK) - le proteine STAT sono esse stesse fosforilate ed i loro domini SH2 si dissociano dal recettore e si legano alla fosfotyr di un altra molecola di STAT scambio di partner (dimero STAT stabile)

24 Interazioni fra macromolecole Scambio di partner e scambio di domini Esempio: proteina del capside del papilloma virus - nella struttura della proteina isolata del capside la regione C-terminale è ripiegata all indietro ed interagisce col resto della proteina - sulla particella del virus il braccio C-terminale invade la subunità adiacente lo scambio di domini stabilizza i trimeri della proteina del capside Esempio: enzima protein chinasi PAK1 (dimero) - il dominio regolatorio di ciascun monomero inibisce il sito attivo del monomero opposto forma inattiva - proteina attivatrice (Cdc42 legata a GTP) si lega al dominio regolatorio, rimuove lo scambio dei domini e libera il sito attivo