BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI

Transcript

1 Seconda Università degli Studi di Napoli DiSTABiF Anno Accademico Corso di Laurea Magistrale in SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA Insegnamento di BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE degli ALIMENTI Prof. Augusto Parente Lezione 18

2 Cross-linkage (polimerizzazione) di molecole enzimatiche La formazione di legami covalenti di enzimi gli uni con gli altri viene chiamata cross-linking. Si ottengono così degli aggregati di molte molecole che sono insolubili. Le molecole si possono legare tra di loro o con una proteina di riempimento inattiva (filler) come l albumina. Per il cross-linkage si usano agenti bifunzionali polimerizzanti: quello più comunemente utilizzato è la glutaraldeide, utilizzata anche nella concia della pelle, come disinfettante, ecc.

3 La polimerizzazione degli enzimi comporta la reazione chimica degli amminogruppi della proteina enzimatica con la glutaraldeide, portando alla formazione di aggregati. Enz Enz Enz Enz Enz

4 Un interessate impiego della glutaraldeide nella biochimica delle proteine è nella determinazione del numero di subunità presenti in una proteina oligomerica. IL PRINCIPIO In condizioni native la glutaraldeide forma ponti tra le subunità vicine. A seconda delle condizioni sperimentali possono reagire due, tre, quattro,.tutte le subunità che compongono la proteina oligomerica. La SDS-PAGE permette di determinare il PM delle specie formatesi.

5 * * GltTBc, trasportatore di Glu da Bacillus caldotenax LL, linker lungo His 6 tag all N-terminale Cross-linking con differenti concentrazioni di glutaraldeide di trasportatori batterici del glutammato: His-GltTBc and LLGltTBc. [GA]: 0.25 mm, pozzetti 4 and 9; 0.5 mm, pozzetti 5 and 10; 2.5 mm, pozzetti 6 and 11; e 5 mm, pozzetti 7 and 12. Campioni di riferimento nei pozzetti 3 and 8. I marcatori di peso molecolare sono nel pozzetto 1 and His-GltTBc è nel pozzetto 2. Le bande I, II, III, and IV Corrispondono al monomero, dimero, trimero ed al dimero del trimero, rispettivamente. Dinesh Yernool et al. Biochemistry 2003, 42,

6 PROBLEMI Se la reazione di cross-linkage avviene correttamente, le molecole enzimatiche possono essere legate in maniera forte ed in modo tale da mantenere la maggior parte dell attività enzimatica. I problemi possono essere: 1- cambiamenti significativi nel sito attivo dell enzima e perdita dell attività enzimatica durante la fase di preparazione. 2- gli aggregati possono essere gelatinosi e diventa quindi più difficile l accesso del substrato. Recentemente sono stati studiati nuovi metodi di cross-linking che portano alla formazione di cristalli. Gli enzimi in questa forma (cross-linked enzyme crystals o CLECs) sono molto stabili.

7 Per generare CLECs si devono controllare accuratamente i parametri di cristallizzazione in modo da avere la formazione di microcristalli. A seguito del cross-linking le proteine non sono più solubili in acqua, sono meccanicamente stabili e facili da maneggiare. A differenza degli enzimi immobilizzati con tecniche classiche, i CLECs mostrano elevata attività catalitica anche ad alte temperature ed in solventi organici. Questo perché il fissaggio delle proteine nel cristallo ed il cross-linking prevengono la denaturazione. Inoltre i CLECs sono stabili alla degradazione dovuta a proteasi, in quanto non sono possibili le interazioni proteina-proteina.

8 Molti enzimi sono stati utilizzati con questa tecnologia. Termolisina-CLEC che catalizza la formazione del legame ammidico nel precursore dell aspartame. Sintesi di un N-alchil-amminoacido con subtilisina CLEC.

9 Aldolasi-CLEC nella formazione stereoselettiva di legami C-C. Idrolisi enantioselettiva con una lipasi-clec da Candida rugosa.

10 Incorporazione in polimeri In questo caso l enzima è miscelato con monomeri sintetici: durante la polimerizzazione si forma un co-polimero nella trama tridimensionale nel quale si alternano monomeri e molecole di enzima. E una sorta di cross-linking, ma in questo caso eterogeneo.

11 Intrappolamento La tecnica comporta l inglobamento delle molecole enzimatiche entro la trama tridimensionale di un polimero, che funge da barriera fisica alla fuoriuscita dei biocatalizatori, che pur essendo imprigionati, conservano la propria attività e reagiscono con i substrati che permeano attraverso i pori del polimero

12 Nell intrappolamento in gel la forma finale del polimero è spesso quella di uno strato relativamente sottile, simile a un foglio di un cilindro). Questo metodo di intrappolamento è molto blando ed applicabile anche alle cellule. Per l agar, ad esempio, si fa sgocciolare una miscela di cellule sospese in una soluzione calda di agar (40 C), dentro una soluzione tampone a 0 C. Il maggior difetto di queste matrici è la loro instabilità a cambi di temperatura e di intorno ionico e la loro instabilità meccanica.

13 Per l intrappolamento in fibre, l intrappolamento fisico dell enzima viene ottenuto sciogliendo il polimero che formerà la fibra (ad es., triacetato di cellulosa) in un solvente organico non miscibile in acqua (cloroformio, metilencloruro) ed emulsionando questa soluzione con una soluzione acquosa dell enzima. Per estrazione, si ottiene poi il polimero precipitato in forma filamentosa, con gocce di soluzione enzimatica intrappolate nella fibra.

14 Nella microincapsulazione l inglobamento avviene all interno di micelle che si formano, sotto agitazione, aggiungendo un polimero disciolto in solvente organico ad una sospensione enzimatica contenente un detergente, in grado di diminuire la tensione superficiale e agevolare la formazione delle microcapsule Se l acqua è presente in piccole gocce che sono circondate dal sapone, la struttura totale è circondata dal solvente organico e rappresenta una micella inversa. Quando l acqua costituisce la fase principale, le micelle possono essere formate da un doppio strato di detergente. Questa struttura è detta vescicola. Gli enzimi si accomodano in questa piscina d acqua e mantengono la loro attività. Lo scambio tra una micella e l altra avviene per contatto ed è un processo molto veloce.

15 VANTAGGI e SVANTAGGI della INCORPORAZIONE IN POLIMERI VANTAGGI Semplicità operativa Basso costo Ridotte perdite di enzima Aumento della stabilità conformazionale SVANTAGGI: La trama tridimensionale dei polimeri non è perfettamente ripetibile nei suoi vari punti: i pori hanno dimensioni differenti e questo può determinare un lento rilascio proteico nel tempo; Fibre, gel e microcapsule sono sensibili alle condizioni operative, quali agitazione, ph; Denaturazione degli enzimi per esposizione a solventi organici; Introduzione di resistenze al trasporto del substrato

16 Immobilizzazione dei cofattori Tutte le tecniche fin qui discusse possono essere utilizzate per enzimi che non necessitano di cofattori e per quelli in cui i cofattori sono saldamente legati. Alcuni enzimi dipendono dai cofattori che facilmente si dissociano nel mezzo e in questo caso il cofattore deve essere immobilizzato per poter far funzionare il sistema di riciclo. Il problema si può risolvere in due modi: 1. Il cofattore può essere legato alla superficie dell enzima crosslinked ; 2. Il cofattore può essere attaccato al carrier macroscopico. In ciascun caso è necessario che il braccio spaziatore sia sufficientemente lungo per poter raggiungere l enzima 1 che dà la reazione e l enzima 2 che permette il riciclo.

17 Cross-linking Ads. Fisico Ads. Chimico LI Ads. Chimico LC Intrappolamento

18 Effetti dell immobilizzazione sulle proprietà dell enzima L immobilizzazione può modificare la cinetica ed altre proprietà degli enzimi, rispetto al loro comportamento in soluzione, che possono essere causati da: 1. Effetti conformazionali si possono verificare cambiamenti nella struttura 3D in seguito a modificazioni di residui amminoacidici che alterano la carica e/o la geometria del sito attivo; 2. Effetti sterici l immobilizzazione limita gli eventuali cambiamenti conformazionali indotti dall interazione enzima-substrato e l interazione con il substrato può essere inibita da ingombro sterico; 3. Effetti di ripartizione si possono instaurare interazioni elettrostatiche o idrofobiche tra la matrice e le specie a basso peso molecolare in soluzione, che portano a modificazioni del microambiente in cui avviene la catalisi 4. Effetti di trasferimento di massa e diffusionali sono dovuti alle difficoltà del substrato di diffondere dalla soluzione al sito attivo dell enzima e da problemi di diffusione del prodotto una volta avvenuta la catalisi; 5. Modificazione della K M l affinità dell enzima per il substrato può aumentare o diminuire

19 A causa degli effetti descritti, spesso i parametri cinetici degli enzimi immobilizzati risultano diversi da quelli degli enzimi in forma libera.

20 Esempi di applicazioni Uno dei processi per via enzimatica condotti su scala industriale che hanno conosciuto maggiore successo è quello per la produzione di uno sciroppo ad elevato contenuto in fruttosio, mediante isomerizzazione del glucosio. Il prodotto che si ottiene ha un potere dolcificante analogo (>) a quello dello sciroppo di glucosio e ha trovato largo impiego nel settore delle bevande, degli alimenti e dei dolci. La glucosio isomerasi è l enzima che catalizza la conversione di glucosio in fruttosio. E un enzima intracellulare abbastanza stabile; la necessità di estrarlo da cellule lo rende più costoso di altri enzimi extra-cellulari. Può essere ricavato dal fungo Saccharomyces cerevisiae.

21 Saccaromices cereviciae. Una delle più interessanti applicazioni industriali degli enzimi immobilizzati per la catalisi enzimatica riguarda la separazione di miscele racemiche, processo messo a punto negli anni 70. La reazione sulla quale il processo si basa è catalizzata dall enzima amminoacilasi e segue il seguente schema: L enzima è in grado di idrolizzare selettivamente solo l isomero L. La miscela di amminoacidi liberi e acilati può essere ora facilmente separata sulla base della diversa solubilità dei due composti. L acil-amminoacido D viene quindi nuovamente racemizzato per riscaldamento e riciclato all inizio del processo. L enzima viene solitamente immobilizzato su una matrice DEAE-Sephadex, che manifesta proprietà di elevata attività, di facile preparazione e rigenerazione e di grande stabilità.