DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI

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1 LEZIONE 16 Sistemi di regolazione SISTEMI DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI In che modo un batterio sente e risponde a specifici segnali provenienti dall ambiente? Per esempio, nel caso dell operone lac la presenza del lattosio nel terreno determina l attivazione dell espressione genica dell operone. Un altro tipo di regolazione è quello operato dall utilizzazione di fattori sigma alternativi che, insieme con altre proteine, regolano l attività dell RNA polimerasi e quindi modulano la trascrizione. Ma in che modo i le cellule batteriche sentono stimoli esterni come per esempio il ph, che non coinvolgono sostanze specifiche e in che modo questi stimoli sono convertiti in segnali interni? In natura, i batteri devono poter recepire e rispondere rapidamente a cambiamenti ambientali quali variazioni nella disponibilità di nutrienti, osmolarità, temperatura etc.. Per questo motivo si è evoluto un sistema piuttosto complesso che è in grado di sentire l esterno e ridirigere l espressione genica in risposta ai segnali percepiti. Questo meccanismo è noto come SISTEMA DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI. Sono noti almeno 24 esempi di questo tipo di regolazione. Quali tipi di segnali esterni vengono riconosciuti? * Osmolarità * Fosfato * Zuccheri * Nitrato * Essudati di piante * Livelli di ossigeno * Livelli d azoto L organizzazione del sistema di regolazione a due componenti è conservata. Tutti i sistemi di regolazione a due componenti consistono di due componenti costituiti da due proteine. Il primo componente è un SENSORE-TRASMETTITORE che attraversa la membrana citoplasmatica. Questa proteina che attraversa tutta la membrana presenta due domini: il dominio esterno costituisce il sensore. E localizzato nello spazio periplasmatico ed è il dominio che riconosce specifici segnali esterni e quindi percepisce il segnale. Il secondo dominio è il dominio trasmettitore che è localizzato nel citoplasma. I due domini sono ancorati alla membrana citoplasmatica da due regioni che attraversano la membrana. Il trasmettitore è capace di autofosforilarsi utilizzando ATP. Durante questa reazione, un gruppo fosfato (PO4) è trasferito ad uno specifico residuo di istidina (His) presente nella proteina. Il dominio trasmettitore contiene anche un attività chinasica che lo rende capace di trasferire il gruppo PO4 ad un secondo componente ricevente-regolatore nel momento in cui viene rilevato il segnale ambientale. Il secondo componente è il RICEVENTE-REGOLATORE che è localizzato nel citoplasma. Anche questo componente è costituito da due domini. Il primo è un dominio ricevente che presenta un residuo di acido aspartico (Asp) che può accettare il gruppo fosfato trasferito dal dominio

2 trasmettitore del primo componente. Il secondo dominio è il regolatore che, in risposta alla presenza di un gruppo PO4 legato al dominio ricevente, può legare a specifiche sequenze di DNA in specifici promotori e attivare l espressione genica. Questi due domini sono legati da un linker flessibile. Tali domini sono altamente conservati tra i sistemi di regolazione a due componenti identificati fino ad ora. Ciò è molto interessante in quanto ogni sistema è altamente specifico per un dato segnale e non ci sono sovrapposizioni tra diversi sitemi. Questo è un chiaro esempio conservazione evoluzionistica e, nello stesso tempo, di indipendenza funzionale. Un altro nome per questo tipo di regolazione genica è trasduzione del segnale poiché un segnale esterno alla cellula viene decodificato all interno della cellula. Il sistema a due componenti OmpR/EnvZ di E. coli Per osmolarità si intende la quantità di soluti in soluzione. Più alta è òla quantità di soluti (fonti di carbonio, sali, ioni etc.), più è alta l osmolarità.. La parete cellulare di E. coli è composta dalla membrana esterna che insieme alla membrana citoplasmatica avvolge lo spazio periplasmatico contenente lo strato di peptidoglicano. La membrana citoplasmatica è la principale barriera di permeabilità, ma non può sostenere un gradiente di pressione. La membrana esterna invece esclude le macromolecole, ma contiene numerosi pori che permettono l ingresso per diffusione di piccole molecole idrofiliche anioniche nello spazio periplasmatico. In questo modo viene mantenuta la pressione osmotica tra il periplasma ed il citoplasma. Le due porine principali sono OmpF e OmpC, codificate rispettivamente dai geni strutturali ompf e ompc. Queste proteine formano dei canali, o pori, nella membrana esterna che consentono il passaggio di molecole con diversa taglia. Ogni canale è formato da tre subunità di porina e OmpF forma dei pori leggermente più grandi rispetto a quelli formati da OmpC. Sebbene il numero di pori rimanga costante nella membrana esterna, il rapporto tra i pori formati da OmpF e OmpC cambia in risposta al grado di osmolarità del terreno che circonda la cellula. * Alta osmolarità: predomina OmpC * Bassa osmolarità: predomina OmpF Es. nell intestino, dove l osmolarità e la temperatura sono elevate, predomina OmpC. In questo modo la cellula si protegge dall ngresso dei sali biliari che sono tossici. Al di fuori dell intestino, l osmolarità e la temperatura sono più basse. In questa situazione predomina OmpF che consente l ingresso nella cellula di un maggior numero di nutrienti. Regolazione dell espressione genica di ompf e ompc in risposta a cambiamenti osmotici In E. coli il pathway di trasduzione consiste di due proteine EnvZ (sensore-transmettitore) e OmpR (recevente-regolatore). ompc è localizzato a 48 minuti sulla mappa di E. coli mentre ompf è localizzato a 21 minuti, indicando che i 2 geni non sono vicini. Comunque, le regioni del promotore di entrambe i geni

3 contengono siti di legame per OmpR nella sua forma fosforilata (OmpR in quanto riceventeregolatore può agire come attivatore della trascrizione solo quando è fosforilato). Il segreto della regolazione risiede nel numero di siti e nell affinità che questi presentano per OmpR-fosforilato. Nel promotore di ompc sono presenti tre siti a bassa affinità per OmpR. Al contrario. Nel promotore di ompf è presente un sito a bassa affinità e due siti ad alta affinità per OmpR. Bassa osmolarità In condizione di bassa affinità, nessun segnale è percepito da EnvZ e quindi OmpR non viene fosforilato (attivato). In ogni caso, nella cellula ci sono sempre alcune molecole di OmpR fosforilate, anche in condizioni di bassa osmolarità; queste poche molecole saranno catturate dai siti ad alta affinità presenti nel promotore di ompf, determinando l espressione del gene ompf. Il risultato sarà un incremento di pori più grandi, formati da OmpF, che permetteranno il passaggio nello spazio periplasmatico di più molecole. Alta osmolarità In condizioni di alta osmolarità, le alte concentrazioni di soluto sono percepite da EnvZ con conseguente fosforilazione di molte proteine OmpR nel citoplasma. A questo punto, l incremento di OmpR fosforilato determina due eventi: 1. OmpR di lega non soltanto ai siti ad alta affinità presenti nel promotore di ompf, ma anche ai siti a bassa affinità presenti nello stesso promotore. Quando OmpR è legato a questi siti a bassa affinità nel promotore di ompf funziona da repressore e quindi la proteina OmpF. OmpR, infatti, è un regolatore della trascrizione che può agire sia da attivatore che da repressore. (Questa caratteristica è comune a molte proteine che legano il DNA; proteine che normalmente agiscono da attivatori possono funzionare da repressori se si legano a dei siti che alcuni autori hanno chiamato zona esclusiva di repressione.) 2. OmpR si lega ai tre siti a bassa affinità presenti sul promotore del gene ompc attivandone la trascrizione. In queste condizioni infatti compaiono i pori piccoli formati dalla porina OmpC. Riassunto: La quantità della proteina ompr fosforilata nella cellula determina quale proteina tra ompf e ompc viene prevalentemente espressa. La quantità di OmpR fosforilata è determinata dalla percezione della pressione osmotica da parte di EnvZ.

4 REGOLAZIONE ANTISENSO Gli RNA antisenso sono piccole molecole di RNA non tradotte che si appaiano a regioni complementari di specifici mrna bersaglio (target). Questo appaiamento determina il cambiamento nell espressione o nella funzione del mrna bersaglio a livello post-trascrizionale. La presenza di RNA antisenso è ben documentata nei procarioti, principalmente nei plasmidi e nei batteriofagi. Inoltre, svolgono un ruolo importante nella regolazione genica sia nei procarioti che negli eucarioti. Gli RNA antisenso contengono molte strutture a forcina (stem-loop: stelo con ansa). I domini presenti nell ansa (loop) sono importanti per la specificità del target mentre le strutture dello stelo (stem) sono coinvolte nella stabilità dell RNA. Gli RNA antisenso sono sintetizzati in due modi differenti 1) Tramite la trascrizione opposta all interno di un gene. Per definizione, la trascrizione di una della doppia elica di DNA sarà 100% complementare al prodotto della trascrizione dell elica opposta. 2) Tramite la trascrizione di una regione non correlata del genoma. In questo caso la sequenza dell RNA antisenso è normalmente complementare alla sequenza target con qualche errore (meno del 100% di complementarietà). Ciò è dovuto al fatto che le due regioni trascritte sono distinte e non c è una selezione per mantenere la complementarietà. Il controllo mediato dall RNA antisenso riguarda le più disparate funzioni biologiche e include la replicazione del DNA plasmidico, la trasposizione, lo sviluppo di batteriofagi e l espressione di specifici geni batterici. Controllo del livello di proteina OmpF Abbiamo precedentemente discusso la regolazione dell espressione genica delle porine ompf e ompc in E. coli attraverso il sistema di regolazione a due componenti EnvZ/OmpR. In questo sistema a due componenti EnvZ e OmpR determinano l espressione di ompf e ompc a seconda della osmolarità dell ambiente circostante. In ogni caso, la cellula ha la necessità di variare la quantità di OmpF nella membrana esterna in risposta ad altri stimoli ambientali quali la presenza di antibiotici specifici ed in risposta a variazioni di temperatura. Il sistema EnvZ/OmpR non risponde a questi segnali quindi, E. coli ha evoluto un altro meccanismo per regolare i livelli di porina OmpF. E. coli contiene un gene, chiamato micf, che codifica per un RNA non tradotto lungo 93 nt (MicF). micf (49.8 ) è fisicamente distante da ompf, ma è localizzato vicino a ompc (49.7 ). MicF è complementare al mrna di ompf al 70%, si può comunque appaiare all estremità 5 del mrna ompf e questo appaiamento impedisce il legame del ribosoma al codone d inizio AUG. In questo modo, MicF inibisce l inizio della traduzione del mrna di ompf mascherando i siti di riconoscimento da parte del ribosoma. MicF non ha un ruolo nell espressione di ompf in risposta a cambiamenti di osmolarità in quanto una delezione di micf non determina cambiamenti sulla quantità di OmpF prodotta in queste condizioni. Tuttavia ha effetto su altri stimoli ambientali quali:

5 1. temperature elevate 2. esposizione al salicilato 3. stress ossidativo Tutte queste condizioni riducono i livelli di ompf tramite la regolazione da parte dell RNA antisenso prodotto da MicF. Inoltre, MicF è anche parzialmente responsabile per gli effetti osservati in: 1. mutanti tolc (resistenti al toluene) 2. mutanti marc (resistenza multipla agli antibiotici) 3. resistanza ai macrofagi E perciò evidente che MicF è coinvolto nella difesa cellulare contro molecole tossiche esterne tramite la riduzione delle porine OmpF sulla membrana esterna.

6 Approfondimento: IL SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO Il sistema del doppio ibrido viene utilizzato per mettere in evidenza l interazione tra proteine in un sistema cellulare, il lievito, quindi in condizioni definite in vivo Questo sistema si avvale della caratteristica struttura a domini di alcuni fattori che regolano la trascrizione e del fatto che questi domini conservano la loro funzione anche quando sono separati dal resto della proteina. Es. la proteina Gal4 possiede un dominio che lega il DNA (BD= DNA binding domain) e un altro dominio che attiva la trascrizione (AD= activation domain). La porzione di proteina tra i due domini può essere sostituita da altre sequenze proteiche non correlate alla proteina. Quando il BD viene isolato dal gene originario e fuso ad un gene X che codifica per una proteina che normalmente non lega il DNA e non attiva la trascrizione, la proteina chimerica che contiene questa fusione sarà in grado di legare il DNA allo stesso sito operatore del BD originario, ma non potrà attivare la trascrizione (manca l AD). Quando l AD viene isolato e fuso ad un gene Y che codifica per una proteina che normalmente non lega il DNA e non attiva la trascrizione, la proteina chimerica è potenzialmente in grado di attivare la trascrizione. Se le proteine X e Y interagiscono, si otterrà la trascrizione del gene a valle del promotore contenente il sito operatore per il sito di legame al DNA ovvero il DNA Binding Domain (BD).

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