Regolazione genica post- trascrizionale

Transcript

1 18. L RNA regolatore contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Regolazione genica post- trascrizionale L espressione genica può essere regolata a livello posttrascrizionale. Non è detto che tutto l mrna che viene trascritto a partire da un certo gene venga utilizzato per sintetizzare la relativa proteina. La regolazione post- trascrizionale dell espressione genica avviene per mezzo di molecole di RNA regolatore. 1

2 Espressione geni è controllata da regolatori che interagiscono con una struttura specifica del DNA o dell mrna srna ( nt) Ex. OxyS RNA sequenza complementare al bersaglio (RNA antisenso): Formazione duplex RNA- RNA Appaiamento RNA oxys con mrna flha fa si che il ribosoma non può legarsi al codone di inizio: TRADUZIONE repressa 2

3 H2O2 activates the transcription activator OxyR, which control the expression of several genes, one of these is OxyS which codes for a srna The gels on the left show that oxys RNA is induced in an oxyr constitutively active mutant. The gels on the right show that oxys RNA is induced within 1 minute of adding hydrogen peroxide to a wild-type culture Attivazione e repressione della traduzione da parte degli srna 3

4 regolazione genica co- traduzionale per attenuazione nei procarioti la traduzione ha inizio mentre l mrna è ancora in corso di trascrizione. La trascrizione della regione leader porta alla sintesi di un mrna che va incontro a cambiamenti di conformazione con la formazione di strutture secondarie a stelo ed ansa 4

5 5

6 Il movimento dei ribosomi determina cambiamenti nella strutura secondaria dell RNA e controlla la terminazione carenza di trp Ribosoma blocca traduzione al livello dei 2 codons per il trp e si fermerà includendo la regione 1 dell attenuatore. regioni 2 e 3 trascritte si possono appaiare per formare la struttura secondaria che dà all RNApol il segnale di antiterminazione. La trascrizione continua fino alla fine, includendo i geni strutturali qta suff di trp ribosoma inserisce aa nella catena e la traduzione continua fino al segnale di stop. ribosoma si fermerà dopo avere incluso una parte della regione 2, che non può appaiarsi con la regione 3. Regione 3 libera di appaiarsi con la regione 4: dà il segnale di terminazione trascrizione alla RNApol 6

7 Inoltre: presenza di trp- trna ribosomi traducono il peptide leader e sono rilasciati Si forma la forcina e la RNApol termina la trascrizione assenza di trp- trna ribosoma è bloccato la forcina di terminazione non si forma e la RNApol continua RIBOSWITCH si possono trovare nella regione 5 - UTR dell mrna: controllano l espressione dell mrna 7

8 Organizzazione dei riboswitch Lega una piccola molecola di ligando che porta a cambiamento conformazionale anche della piattaforma adiacente Ex. Riboswitch sensibile a S-adenosilmetionina (SAM) Possono regolare Terminazione della trascrizione Inizio della traduzione 8

9 Cambiamenti nella struttura secondaria del riboswitch che risponde alla SAM Ex 1. produzione di glucosammina- 6- fosfato (GlcN6P): intermedio sintesi parete batterica Sull mrna dell enzima che sintetizza GlcNP6 si trova un RIBOZIMA che ha attività di endonucleasi (taglio) se attivata dal prodotto metabolico (GlcNP6)!GlcNP6 "attiva RIBOZIMA "taglio mrna Il Riboswitch è dunque un RNA la cui attività è controllata dal prodotto metabolico 9

10 Ex 2. di ribointerruttore batterico: geni per la biosintesi delle purine trascritti in base a livelli di G e conformazione dell mrna In assenza di G questa struttura a doppio filamento non si forma perché uno dei filamenti di RNA è accoppiato con una regione del biointerruttore Altri ESEMPI Proteina si lega all apposita sequenza di riconoscimento del ribosoma situata all inizio del gene Es di riboswitch batterico (Listeria monocytogenes): geni di virulenza tradotti solo se la T alta: la T corporea dell ospite umano denatura la forcina e l mrna mrna della Listeria contiene sequenza di RNA termosensibile che controlla la traduzione di un gruppo di geni per la virulenza Nell uomo la T alta denatura sequenza termosensibile ed i geni si esprimono 10

11 - Legame di una piccola molecola al biointerruttore - riarrangiamento strutturale RNA - sequestro sequenza di riconoscimento per il ribosoma - NO trascrizione Struttura di 7 riboswitch e dei metaboliti cui essi rispondono 11

12 anche gli Eucarioti contengono RNA regolatore MA a livello dell INIZIO e non della Terminazione Come avviene nei batteri NB la membrana nucleare separa I processi di TRASCRIZIONE e TRADUZIONE Inoltre mrna eucar è + stabile di quello batterico: Il controllo maggiore avviene a livello della TRADUZIONE Caratteristiche RNA regolatore è in grado di legarsi ad una molecola di mrna impedendone la traduzione. riconosce il suo bersaglio in base al principio di appaiamento complementare delle basi. ha una certa struttura secondaria, ed una regione a singolo filamento complementare ad una regione a singolo filamento dell mrna bersaglio. 12

13 RNA non codificanti (ncrna) tipi di ncrna trna (RNA transfer): adattatori per la conversione del codice genetico a triplette nel codice amminoacidico delle proteine. rrna (RNA ribosomiali): all interno dell apparato traduzionale svolgono sia funzione strutturale che catalitica (formazione del legame peptidico). snrna (Piccoli RNA nucleari): componenti critici dello spliceosoma e svolgono un ruolo importantissimo nella maturazione degli mrna. snorna (Piccoli RNA nucleolari): implicati nel processamento e nella maturazione degli RNA ribosomali e di altri tipi di RNA, aumentandone l attività. mirna e sirna: piccoli RNA in grado di regolare l espressione genica a livello post- trascrizionale, silenziando specifiche molecole di mrna. pirna: coinvolti nel silenziamento trascrizionale dei retrotrasposoni nelle cellule germinali 13

14 L appaiamento di una molecola di RNA regolatore ad una regione a singolo filamento di mrna può provocare: L inibizione della traduzione senza distruzione della molecola di mrna La degradazione della molecola di mrna In entrambi i casi si ha il silenziamento del gene, il cui effetto è la mancata produzione della proteina corrispondente. Perché un RNA regolatore possa legarsi ad una molecola di mrna bersaglio: La regione di legame sul bersaglio deve essere accessibile, ovvero meno stabile (deve contenere una regione, anche piccola, a singolo filamento). Il legame con l RNA regolatore deve essere energeticamente favorevole. Accessibile Non accessibile RNA antisenso Target RNA 5 - AGGACTACCGACTAGCATA TCCTGATGGCTGATCGTAT- 5 Antisense RNA A volte il gene antisenso si trova sul filamento opposto a quello del gene bersaglio, pertanto i due RNA saranno perfettamente complementari. Altre volte gli RNA antisenso vengono trascritti da altre regioni del genoma, per cui si potrebbe avere una parziale complementarità delle loro basi. RNA antisenso complementare prodotto da un altro gene si appaia con mrna specifico e blocca traduzione 14

15 L interferenza dell RNA (o RNAi) Ė una forma di silenziamento genico mediata da un doppio filamento di RNA (dsrna). Quale è la funzione biologica dell RNA interference? L irna svolge un ruolo protettivo del genoma da situazioni di instabilità causate da transgeni e trasposoni. Costituisce un meccanismo di difesa contro attacchi virali. Regola l espressione genica (microrna). 15

16 Andrew Z. Fire Craig C. Mello certe regioni genomiche codificano per alcune brevi molecole di RNA (dette genericamente microrna), in grado di ripiegarsi a formare una forcina (short hairpin RNA, o shrna). 16

17 I mirna sono trascritti da RNAPol II come precursori piu lunghi (pri- mirna) con struttura a forcina, maturati nel nucleo a pre- mirna ed esportati nel citoplasma Nel citoplasma, i pre- mirna vengono maturati a mirna ad opera di nucleasi chiamate DICER: 17

18 I mirna maturi vengono inglobati in un complesso RISC (RNA- Induced Silencing Complex), che svolge la doppia elica e viene guidato dal filamento anti- senso sull mrna bersaglio, inibendone la traduzione NB Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo avvenire diverse volte in quanto l RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo agire per 3-7 giorni. 18

19 Meccanismo d azione mirna due modi diversi d agire a seconda della complementarietà che vi è tra il mirna e il suo target 1. Complementarietà imperfetta bloccano l espressione dei loro geni target a livello post- trascrizionale Per inibire la traduzione legano solitamente le regioni non tradotte al 3 (3 UTR), per le quali presentano omologia 2. Complementarietà perfetta legano i loro RNA bersaglio con complementarietà perfetta inducono il taglio del bersaglio che non può più essere tradotto In questo caso i mirna trovano la loro regione di omologia o nell ORF(open reading frame) o nella sequenza codificante microrna (mirna) 1. Un solo mirna può regolare un intero gruppo di mrna diversi con sequenze comuni 2. Gene che codifica mirna occupa poco spazio nel genoma 3. Nell uomo oltre 400 mirna diversi 19

20 La regione 5 mirna è chiamata seed: la regione più importante nel silenziamento. solitamente tra i 7-10 nucleotidi, ma esistono seed più corti o più lunghi. solitamente appaiata in modo perfettamente complementare al suo target: Il primo nucleotide del mirna non è determinante e può non essere appaiato. regione a valle del seed contiene solitamente un loop: Riassumendo mirna: La loro espressione e altamente regolata durante lo sviluppo regolano l espressione dei geni bersaglio a livello della traduzione, bloccando l attacco del ribosoma - > non mediano la degradazione dell RNA bersaglio (tranne che nelle piante) L omologia con l RNA bersaglio e a livello della regione 3 UTR, e non e completa. Quando l omologia e completa mediano DEGRADAZIONE DELL RNA BERSAGLIO Rappresentano un importante livello di regolazione dell espressione genica! 20

21 Funzioni dei mirna controllo di numerosi processi fisiologici: Sviluppo Differenziamento cellulare Apoptosi down up regulation mirna sono correlate a diversi tipi di patologie: Cancro Malattie neurodegenerative Malattie cardiache Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è fondamentale nella comprensione dei processi biologici, dei fenotipi patologici e, di conseguenza, nel design di terapie innovative. mirbase banca dati ufficiale dei mirna Contiene le sequenze dei mirna maturi e degli stemloop precursori, oltre a riferimenti bibliografici ed informazione sui target. si conoscono circa500 mirna nell uomo ma solo per il 10% di essi è stato individuato almeno un target. servizi di predizione di target per mirna: TargetScan PicTar miranda 21

22 piccoli RNA interferenti: sirna, small interfering DNA rappresentano un altra classe di piccoli RNA non codificanti pur presentando numerose analogie con i mirna in termini di struttura e biogenesi, svolgono funzioni essenzialmente diverse sirna si producono a partire da lunghe molecole di RNA prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula, quali trasposoni,virus o transgeni: un sistema di difesa contro l invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma sirna agiscono solo per complementarietà perfetta per cui ogni sirna può avere un unico mrna bersaglio Diversamente, i mirna costituiscono una numerosa classe di geni endogeni filogeneticamente conservati, la cui funzione è di inibire l espressione genica principalmente attraverso l inibizione della traduzione Ogni mirna, per il suo caratteristico meccanismo d azione può avere più di un mrna bersaglio 22

23 23

24 24

25 sirna IN STUDI CLINICI Potenziali effetti collaterali della terapia con sirna: 1. Attivazione del sistema immunitario 2. Effetti off- target 3. Saturazione di vie di silenziamento endogene (mirna) 25