RNA interference. La tecnologia dell RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico

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1 RNA interference Tecnica che permette di interferire con l espressione di alcuni geni mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l RNA messaggero corrispondente. La tecnologia dell RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico In natura la cellula necessita di questo tipo di soppressione genica post-trascrizionale per combattere eventuali infezioni causate da virus dotati di genoma a dsrna, o da microrganismi patogeni in grado di produrre dsrna durante il loro ciclo replicativo. Oggigiorno gli esperimenti condotti per provocare l interferenza mirata possono avvenire in cellule di diversi organismi e si avvalgono dell utilizzo di sequenze di circa 20bp. Sequenze più lunghe,infatti,provocherebbero una generale distruzione di tutto l mrna cellulare,nonché stimolerebbero la produzione di IFNgamma,una citochina proinfiammatoria rilasciata in caso di infezione virale. Selezionata la sequenza ottimale si procede alla trasfezione cellulare facendo ricorso ad uno dei tre metodi maggiormente utilizzati: -Trasfezione diretta con RNAds -Trasfezione di un plasmide contenente due sequenze che codificano per il senso e l antisenso dell RNA che si vuole produrre. Una volta trasfettata,la cellula produrrà i due strand dell RNA che si uniranno a formare RNAds -Trasfezione con un plasmide contenente una sequenza che codifica per uno shrna (small hairpin RNA),cioè un RNA unico che contiene la sequenza senso,uno spacer (5-6 basi)e la sequenza antisenso.questo RNA avrà una struttura a forcina,poiché il senso e l antisenso si uniranno. Il metodo vector-based per l'rna interference rende possibile lo spegnimento di geni in maniera molto specifica nella cellula differenziata e il suo effetto è persistente, al contrario dei primi metodi per l'rnai utilizzati nei mammiferi. 1

2 L interferenza da RNA (RNAi) è un processo di silenziamento genico che avviene a livello post-trascrizionale. L innesco della RNAi è costituito da molecole di RNA a doppio filamento (dsrna). Queste molecole subiscono un processo di modificazione che le trasforma in brevi RNA di nucleotidi di small interfering RNA (sirna)generati dal taglio di dsrna più lunghi ad opera di un enzima dimerico denominato Dicer, appartenente alla famiglia delle RNasi di classe III. Il filamento antisenso del sirna serve da stampo per il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) che riconosce e taglia un mrna complementare. Studi recenti indicano che questi piccoli frammenti di dsrna di 21 nucleotidi sono in grado di sopprimere in modo specifico l espressione di geni endogeni ed eterologhi in diverse linee cellulari di mammifero. Ad un certo stadio inoltre questo segnale di allarme viene amplificato dalla duplicazione dell'rna estraneo attraverso una RNA polimerasi RNA-dipendente. I frammenti di 21 nucleotidi vengono ulteriormente degradati a duplex di nucleotidi, che presentano estremità sporgenti costituite da due nucleotidi. Questi frammenti di RNA prodotti sono a singolo filamento e possono legarsi all'rna ospite impedendone la traduzione. 2

3 Poiché alcuni genomi virali sono composti da dsrna, si pensa che il macchinario della RNAi rappresenti una antico meccanismo altamente conservato che difende il genoma da questi virus. L infezione virale produce dsrna intermedi che sono modificati dal macchinario della RNAi dell ospite in sirna che indirizzano quindi gli RNA virali alla distruzione. Il macchinario della RNAi è anche usato dalla cellula stessa per regolare l attività dei geni tramite microrna (mirna). I mirna sono brevi molecole di RNA che si ripiegano a forcina per creare un dsrna che innesca il meccanismo della RNAi. La scoperta dell RNAi La scoperta dell RNAi avvenne casualmente. Nel 1990, alcuni ricercatori stavano tentando di ingegnerizzare le petunie per produrre fiori rossi o viola più scuro. Per ottenere questo risultato volevano introdurre copie addizionali di un gene che codifica per un enzima chiave della biosintesi del pigmento dei fiori. Il risultato ottenuto (fiori bianchi e variegati) indicava che l espressione del transgene introdotto e del gene endogeno era stata spenta. I livelli di mrna endogeno erano ridotti di 50 volte rispetto al wild type. In seguito si studiò il silenziamento su altri organismi. 3

4 Nel 1998 Fire e Mello scoprirono che l iniezione di dsrna silenziava solo gli mrna complementari. Il dsrna doveva includere regioni esoniche. I dsrna corrispondenti a introni o a sequenze del promotore NON provocavano RNAi. 1 stadio-iniziale. I dsrna sono processati da un enzima dimerico, DICER (RNasiIII), che taglia il dsrna in tanti sirna (21nt). 1 stadio-iniziale. I dsrna sono processati da un enzima dimerico, DICER (RNasiIII), che taglia il dsrna in tanti sirna (21nt). 2 stadio-effettore. sirna vengono incorporati in un secondo complesso enzimatico endonucleasico, RISC (RNA induced silencing complex), che usa il filamento anti-senso dell sirna per riconoscere, in base all appaiamento delle basi, il substrato da degradare. RISC contiene un attivita elicasica ATPdipendente che serve a separare i due filamenti di RNA 4

5 1 stadio-iniziale. I dsrna sono processati da un enzima dimerico, DICER (RNasiIII), che taglia il dsrna in tanti sirna (21nt). 2 stadio-effettore. sirna vengono incorporati in un secondo complesso enzimatico endonucleasico, RISC (RNA induced silencing complex), che usa l sirna per riconoscere, in base all appaiamento delle basi, il substrato da degradare. RISC contiene un attivita elicasica ATP-dipendente 3 o stadio - amplificazione: sintesi di nuovo RNA ds da parte di una RNApolimerasi RNA-dipendente Modello degli stadi dell RNAi RNAsi ATP-dip. amplificazione + RISC (elicasi ATP-dip.) Applicazioni La repressione dell espressione di un gene permette di controllare il RUOLO DEL PRODOTTO del gene nella cellula. Poiché l RNAi può non annullare totalmente l espressione del gene nella cellula si parla di Knockdown, per distinguere questo metodo da quelli di Knockout in cui viene rimossa la sequenza del gene. In medicina si spera di poter utilizzare il Knockdown dell espressione di geni correlati a malattie umane. Il primo trial clinico di terapia con irna per la degenerazione maculare dell occhio è stato avviato nell ottobre

6 I microrna I microrna sono codificati da geni specifici detti MIR. I geni sono trascritti dalla Polimerasi II Il trascritto primario forma una struttura secondaria detta a stemloop La proteina DICER produce il mirna a doppio filamento che viene esportato dal nucleo al citoplasma Qui il mirna maturo viene incorporato nel complesso proteico detto RISC. Meccanismo di azione dei microrna A. Un mirna si appaia con un alto grado di omologia al trascritto del gene bersaglio e attiva il suo taglio. B. Una o più copie del mirna si appaiano con un basso grado di omologia al trascritto, bloccando l azione dei ribosomi e quindi la traduzione. Data l omologia tra mirna e mrna bersaglio, si possono disegnare molti software che, analizzando le sequenze genomiche, individuino possibili geni bersaglio. 6

7 Espressione dei microrna L over-espressione del mir156 e mir172 nella pianta Arabidopsis causa un evidente alterazione del fenotipo. Quanti e quali mirna? In ogni organismo è stimato che ci sia un numero di geni MIR pari a 1-5% dei geni codificanti per proteine Si stima che il 30% dei geni codificanti per proteine siano regolati dai mirna Tra le diverse specie vegetali e animali molti mirna sono conservati. Nei vegetali i mirna sono coinvolti in processi quali: morfogenesi ed organogenesi (organi fiorali, foglie ) risposta a stress (mancanza di nutrienti, freddo ) risposta a patogeni Negli animali e in uomo i mirna sono coinvolti in: sviluppo embrionale, organogenesi ( cuore, sistema nervoso ) cancro, linfomi altre sindromi congenite Molti virus, inoltre, codificano per mirna e sono coinvolti nel ciclo infettivo. I mirna sono espressi in modo tissutospecifico L espressione dei mirna varia nei tumori rispetto al tessuto sano 7