Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

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1 Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

2 COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi viventi al fine di produrre beni e servizi.

3 COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie l utilizzazione integrata di biochimica, biologia cellulare e ingegneria genetica per realizzare applicazioni tecnologiche a partire dalle proprietà di microorganismi, di colture cellulari ed altri agenti biologici (Federazione Europea Biotecnologie).

4 COSA SONO GLI OGM organismo il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l'accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale" (Art. 2, Direttiva 2001/18/CE del 12/03/01) Quando si parla di Ogm oggi si intende di microorganismi, animali e piante che hanno un patrimonio genetico modificato in laboratorio, inserendo geni provenienti da organismi diversi, tramite le moderne tecniche del DNA ricombinante.

5 COSA SONO GLI OGM Gli OGM vengono quindi oggi ottenuti attraverso l uso di tecniche di ingegneria genetica che permettono di inserire, all interno del genoma di un organismo, frammenti di DNA provenienti anche da altri esseri viventi. Il DNA così ottenuto è definito DNA ricombinante. L organismo Ogm che risulta da questa manipolazione non è necessariamente totalmente diverso, anzi generalmente è apparentemente identico, ma possiede una qualche caratteristica di utilità.

6 ingegneria genetica

7 La tecnologia del DNA ricombinante Nasce negli Stati Uniti nei primi anni 70, grazie agli studi sui microorganismi, in particolare Escherichia coli. La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri, grazie alla scoperta dei Plasmidi e degli Enzimi di Restrizione, strumenti chiave della clonazione genica.

8 Escherichia coli

9 Escherichia coli

10 plasmidi

11 plasmide

12 enzimi di restrizione Sono enzimi presenti nei procarioti che difendono il batterio dal DNA estraneo, tagliandolo in punti specifici (sequenze palindrome).

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14 plasmide

15 Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano: enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano in punti precisi; l enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di DNA (tagliati con lo stesso enzima di restrizione) permettendo la formazione di un unico filamento continuo.

16 Produzione di DNA ricombinante tramite l uso di enzimi di restrizione e dell enzima DNA-ligasi: L enzima di restrizione riconosce la sequenza 1 DNA L enzima di restrizione taglia il DNA in frammenti G A A T T C C T T A A G 2 Aggiunta di un frammento di DNA di provenienza estranea Estremità coesiva 3 Due frammenti si attaccano tra loro appaiando le basi azotate 4 G A AT T C C T TA A G G A AT T C C T TA A G L enzima DNA-ligasi incolla i frammenti 5 DNA ricombinante

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18 Ottenuto un plasmidio ricombinante si possono ottenere copie tramite clonazione: I plasmidi entrano nei batteri per trasformazione. I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in condizione di riprodursi, dando origine a un clone di cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni che trasportano.

19 Clonazione genica di un gene in un plasmide batterico: E.coli Plasmide 1 Si isola il DNA da due fonti diverse 2 Si tagliano entrambi i DNA con un enzima di restrizione Gene V Estremità coesive DNA Cellula umana 3 Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono mediante appaiamento di basi azotate 4 Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con legami covalenti Plasmide con DNA ricombinante Gene V Batterio ricombinante 5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite trasformazione 6 Si clona il batterio Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano

20 Clonazione genica: I ricercatori possono inserire in un plasmide un pezzo di DNA contenente un gene dando origine a DNA ricombinante. Il plasmide viene poi introdotto nella cellula batterica. Il batterio geneticamente modificato è messo in coltura e si riproduce per formare un clone di cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula madre da cui derivano). Ogni cellula possiede una copia del gene.

21 I geni clonati possono essere conservati in «librerie» genomiche L intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun, derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una cellula, è chiamata libreria genomica. Plasmide ricombinante Genoma tagliato con l enzima di restrizione DNA fagico ricombinante oppure Clone batterico Libreria plasmidica Clone fagico Libreria fagica

22 Si può produrre DNA da clonare anche mediante l enzima trascrittasi inversa L enzima trascrittasi inversa può essere usato per ottenere librerie di DNA complementare (cdna) contenenti solo i geni espressi da un particolare tipo di cellula.

23 pcr (polymerase chein reation)

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25 Per ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA si utilizza comunemente la tecnica PCR Quando il campione di DNA è scarso o impuro, la reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, o PCR) è un metodo più appropriato per ottenere un grande quantitativo di un particolare gene. Molecola iniziale di DNA Numero di molecole di DNA

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27 Thermus aquaticus

28 taq polimerasi

29 elettroforesi

30 L elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni - Miscela di molecole di DNA di dimensioni diverse Generatore elettrico + Gel + + Disposizione finale Molecole più lunghe Molecole più corte

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32 Un impronta genetica (DNA fingerprint) può aiutare a risolvere in crimine: Sangue dell imputato Sangue rinvenuto sui vestiti dell imputato Sangue della vittima

33 Coltura batteri in Petri Dish

34 marcatore di resistenza antibiotico Il processo di clonazione genica non è efficiente al 100%, la maggior parte dei batteri in una coltura non viene trasformata. Si inserisce allora nel plasmide ricombinante un gene di resistenza ad un antibiotico. Solo i batteri che sono stati trasformati con il plasmide, quindi solo i ricombinanti, possono crescere in una coltura che contiene l antibiotico.

35 Microorganismi GM: utilità La tecnologia del DNA ricombinante ha un enorme impatto sull industria alimentare e farmaceutica e sulla medicina umana. I microorganimi GM sono ampiamente utilizzati per: la ricerca biochimica o cellulare e lo studio e la diagnosi (ed in futuro la cura) delle malattie per produrre farmaci, vaccini o enzimi alimentari.

36 microorganismi GM I batteri geneticamente modificati si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico (ma si utilizzano all occorrenza anche cellule eucariote come lieviti o colture cellulari vegetali o animali).

37 insulina

38 ormone della crescita (GH)

39 L insulina e l ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l uso della tecnologia del DNA ricombinante. Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.

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41 Vaccini Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado i sintetizzare anche nuovi vaccini. Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva.

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43 Ricerca Biologica, Diagnosi e cura delle malattie In campo medico la tecnologia del DNA ricombinante è sempre più usata per comprendere i processi biochimici e cellulari della vita. Queste nuove conoscenze permettono di diagnosticare e curare le malattie.

44 terapia genica Una malattia genetica è una malattia che si trova nei geni dell individuo; può essere dovuta alla presenza di uno o più alleli che producono proteine con struttura e funzionalità anomala o alla mal regolazione nell espressione di geni normali. Il numero delle malattie genetiche è molto alto: circa 7000, solo circa un migliaio diagnosticabili e ancora meno sono quelle che hanno una cura. Una malattia è considerata rara quando ha una prevalenza nella popolazione generale inferiore ad 1 caso su 2000 abitanti.

45 terapia genica

46 Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la cura per molte malattie genetiche. La terapia genica può correggere le malattie imputabili a un singolo gene difettoso, sostituendolo o integrandolo con un allele normale. Gene clonato (allele normale) 1 Inserimento del gene normale nel virus Acido nucleico virale Retrovirus 2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus 3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi Cellule di midollo osseo del paziente Midollo osseo 4 Le cellule vengono iniettate nel paziente

47 David Vetter ( ) SCID

48 scid

49 -SCID è la prima malattia al mondo ad essere curata con la terapia genica del sangue è sicura ed efficace. Questi risultati aprono la strada alla terapia genica con cellule staminali in altre forme di immunodeficienze ereditarie, ma anche nelle talassemie e in alcune malattie metaboliche degenerative del sistema nervoso, su cui la Fondazione Telethon sta già lavorando. -TIGET hanno prelevato le cellule staminali del midollo dei piccoli pazienti e hanno inserito in laboratorio una copia sana del gene ADA, corrette, queste sono ritornate nel midollo osseo e hanno iniziato a produrre cellule cellule staminali corrette continuano a essere presenti e attive nel produrre cellule del sangue, tra cui i linfociti, a distanza di molti anni dalla terapia. Il sistema immunitario dei bambini è ora in grado di funzionare normalmente, distruggendo i virus e producendo gli anticorpi che li proteggono dalle infezioni. Il ripristino del normale metabolismo ha consentito ai bambini di cominciare a crescere e svilupparsi come i loro coetanei. Lo studio clinico ha fornito anche importanti informazioni sulla sicurezza della terapia genica, perché non sono stati osservati tossicità o eventi avversi legati alla terapia genica. Oggi si può finalmente dire che il trattamento genico dell'ada-scid è efficace dopo molti anni: i primi nove bambini che vivevano isolati dal resto del mondo sono cresciuti, vanno a scuola, fanno una vita normale e hanno ormai dimenticato di essere stati malati. Di recente altri tre bambini hanno ricevuto la terapia genica -TIGET e anche per loro la cura si avvia ad essere un successo.

50 La terapia genica potrebbe un giorno essere usata per curare sia le malattie genetiche, sia le malattie non genetiche. Anche se è uno strumento molto promettente, esistono ancora poche prove scientifiche evidenti della sua efficacia. La terapia genica sull uomo solleva problemi sia tecnici sia etici (bioetica).