Controllo post-trascrizionale dell espressione genica

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1 Controllo post-trascrizionale dell espressione genica

2 Livelli di controllo dell espressione genica

3 Rivisitazione del concetto di gene Per gli organismi eucariotici più evoluti il dogma un gene = una proteina non vale per la maggior parte dei geni -> possibilità di produrre mrna alternativi a partire dallo stesso gene dovuti a regolazione alternativa di: inizio della trascrizione terminazione della trascrizione splicing Questi meccanismi sono spesso finemente regolati durante lo sviluppo e il differenziamento dei diversi tessuti. Percio più che di geni è corretto parlare di unità trascrizionali. Per molte unità trascrizionali si assiste ad una combinazione di questi meccanismi, con il risultato di una regolazione estremamente complessa.

4 Esempio di poliadenilazione alternativa Anticorpi secreti Anticorpi di membrana

5 Esempio di poliadenilazione alternativa: anticorpi secreti o di membrana

6 Esempio estremo di splicing alternativo Gene DSCAM di Drosophila

7 Come può essere controllato lo splicing?

8 Controllo del trasporto dell RNA

9 Controllo della localizzazione dell RNA

10 Controllo della localizzazione dell RNA e sintesi locale delle proteine

11 Le Scienze web news

12 Il nobel per l interferenza dell RNA Andrew Fire e Craig Mello, i due vincitori del Premio Nobel 2006 per la Medicina e la Fisiologia. I due biologi molecolari vengono premiati per aver scoperto uno dei meccanismi fondamentali per il controllo dell informazione genetica.

13 Regolare l espressione genica tramite molecole di RNA I batteri usano numerosi sistemi in cui dei frammenti di RNA anti-senso vengono sintetizzati da un gene separato e interferiscono Con la traduzione Con la stabilita Con la terminazione del trascritto C.Elegans: small temporal RNAs Anche in eucarioti, l espressione di frammenti di RNA anti-senso di un gene porta ad inattivazione dell mrna codificante, sia nel nucleo che nel citoplasma: NATURAL ANTI-SENSE TRANSCRIPTS (NATs)

14 NATURAL ANTI-SENSE TRANSCRIPTS (NATs) cis-nats: trascritti in cis da filamenti di DNA opposti sullo stesso locus genomico trans-nats: trascritti in trans da loci separati: microrna (mirnas) = strnas

15 La scoperta dell interferenza dell RNA (RNA interference) Fenomeni di interferenza con l espressione genica mediati da RNA il cui meccanismo era però ignoto sono stati notati fin dalla fine degli anni 80 in diversi organismi, e battezzati con nomi diversi: piante: post-transcriptional gene silencing (PTGS) co-soppressione resistenza ai virus mediata da RNA Funghi: silenziamento (quelling in Neurospora) 1990: Co-soppressione: fenomeno per cui l introduzione di un transgene silenzia sia il transgene che il gene endogeno (petunie transgeniche - Jorgensen, 1990, TIBs 8, 340) RNAi compresa solo dopo gli esperimenti di Fire e Mello (Fire et al., 1998, Nature 391, 806) in C. Elegans

16 Scoperta dell RNAi nel nematode Cenorabditis Elegans Nel 1998 Fire e Mello hanno osservato che l RNA ds (a doppio filamento) e molto piu efficace dell RNA antisenso a singolo filamento nel sopprimere l espressione del gene bersaglio. L osservazione è nata da quello che nell intenzione degli autori doveva essere un controllo negativo! hanno quindi testato su diversi geni gli effetti di molecole purificate senso o anti-senso, singolarmente oppure in combinazione.

17 L osservazione originale di Fire e Mello: l RNA a doppio filamento fenocopia un allele inattivato. Contro il gene unc-22 = al fenotipo di unc-22 inattivo Fire et al., 1998, Nature 391, 806

18 Introduced mex3 dsrna eliminates endogenous mex3 RNA Neg ctrl - no staining Pos ctrl - heavy staining antisense mex3 RNA mex3 dsrna Fire et al 1998 Nature

19 Fire e Mello, scoperte chiave: l RNA anti-senso a singolo filamento agisce come inibitore poco efficiente l RNA senso appaiato al suo RNA anti-senso e un inibitore molto piu potente (presumibilmente agendo come RNA ds cioè a doppio filamento) Fenotipi mutanti possono essere indotti efficacemente solo con sequenze complementari a sequenze esoniche -- suggerendo che il silenziamento avvenga a livello post-trascrizionale

20 L interferenza dell RNA (o RNAi) processo mediante il quale RNAds silenzia, in modo sequenza-specifico, l espressione di geni omologhi attraverso l appaiamento con l mrna bersaglio seguito dalla sua degradazione: silenziamento post-trascrizionale. Meccanismo biochimico conservato (dalle piante, ai funghi, agli animali). Probabilmente coinvolge piu di 10 geni (analisi genetica) e gruppi di proteine correlate Funzioni biologiche: -Resistenza ai virus (piante) -Silenziamento trasposoni -Regolazione dell espressione genica La sua funzione anti-virale e dimostrata chiaramente in piante (e insetti) dalla presenza nei virus di geni che codificano soppressori dell RNAi, importanti per la virulenza, mentre non è ancora provata nei vertebrati. La sua funzione di silenziamento dei trasposoni e dimostrata dall osservazione che l inattivazione di geni coinvolti nell RNAi nei nematodi causa l attivazione di molti trasposoni nella linea germinale

21 Come funziona l interferenza dell RNA

22 Modello degli stadi dell RNAi RNAsi ATP-dip. + RISC (elicasi ATP-dip.)

23 Il dsrna puo essere introdotto dall esterno, interferendo cosi artificialmente con l epressione del gene bersaglio RNAsi ATP-dip. + RISC (elicasi ATP-dip.)

24 Interferenza dell RNA: RNAi è un processo di silenziamento post-trascrizionale mediato da RNAds Vista la sua conservazione dai funghi all uomo, è logico pensare che svolga funzioni biologiche fondamentali Funzioni biologiche note: Resistenza ai virus (piante, insetti) Silenziamento trasposoni Regolazione dell espressione genica: i microrna

25 I mirna sono trascritti da RNAPol II come precursori piu lunghi (pri-mirna) con struttura a forcina, maturati nel nucleo a pre-mirna ed esportati nel citoplasma

26 Nel citoplasma, i pre-mirna vengono maturati a mirna ad opera di DICER:

27 I mirna maturi vengono inglobati in un complesso simile a RISC, che svolge la doppia elica e viene guidato dal filamento anti-senso sull mrna bersaglio, inibendone la traduzione

28 Quindi i mirna regolano la trascrizione avvalendosi delle stesse vie enzimatiche dell interferenza dell RNA.

29 I micro-rna: La loro espressione e altamente regolata durante lo sviluppo regolano l espressione dei geni bersaglio a livello della traduzione, bloccando l attacco del ribosoma -> non mediano la degradazione dell RNA bersaglio (tranne che nelle piante) L omologia con l RNA bersaglio e a livello della regione 3 UTR, e non e completa. Quando l omologia e completa mediano DEGRADAZIONE DELL RNA BERSAGLIO Rappresentano un ulteriore livello di regolazione dell espressione genica!

30 Unita trascrizionali e geni codificanti 1997: predetti 100,000 geni nel genoma di mammiferi 2004: scoperti solo 25,000 geni (14,000 in C. Elegans, 17,000 in Drosophila) Cio nonostante il 62% del genoma e trascritto! Ci sono 181,000 trascritti indipendenti: molti sono generati grazie all uso di promotori, PA o splicing alternativi circa la meta sono RNA non codificanti, molti NATs (70% delle unita trascrizionali mappate si sovrappongono parzialmente con un trascritto sul filamento opposto) mirnas: ~1% dei geni eucariotici, presenti in tutti i metazoi e nelle piante Drosophila: 78 C. Elegans: 116 A. thaliana: 112 homo sapiens: >300

31 Il nobel per l interferenza dell RNA 1) Scoperta di uno dei meccanismi fondamentali per il controllo dell informazione genetica, fino ad allora rimasto completamente inosservato. 2) Questa scoperta apre immense prospettive terapeutiche fornendo un nuovo approccio estremamente efficiente alla cura di malattie mediante interferenza con l espressione di geni patologici