Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 22

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 22

2 La trascrizione procariotica dell RNA Concetti chiave: L RNA polimerasi è simile alla DNA polimerasi nella struttura e nel meccanismo. La trascrizione batterica comincia con il legame dell oloenzima RNAP a un promotore per srotolare il DNA. Non appena la polimerasi estende in modo processivo una catena di RNA, un altra polimerasi può iniziare la trascrizione. Nei procarioti la terminazione della trascrizione dipende da sequenze di terminazione intrinseche o dal fattore Rho.

3 La trascrizione procariotica dell RNA Un sistema enzimatico converte l informazione genetica di un segmento di DNA a doppia elica in una catena di RNA che avrà una sequenza di basi complementare a una delle due eliche di DNA.

4 La trascrizione procariotica dell RNA L informazione contenuta nel DNA diventa utilizzabile quando viene espressa sotto forma di RNA e proteine. La sintesi dell RNA è una tappa fondamentale dell espressione dell informazione genetica. La trascrizione produce non solo l RNA messaggero (mrna), ma tutti i tipi di molecole di RNA, stabili e a breve emivita. Tutte le molecole di RNA prodotte dalla trascrizione partecipano al processo di espressione genica.

5 La trascrizione procariotica dell RNA Vengono prodotti tre tipi principali di RNA: RNA messaggero (mrna), RNA transfer (trna), RNA ribosomale (rrna).

6 La trascrizione procariotica dell RNA L RNA èsintetizzato dalle RNA polimerasi. La somiglianza tra le strutture rivela che gli enzimi hanno una comune origine evolutiva e hanno in comune molte caratteristiche del loro meccanismo d azione.

7 La trascrizione procariotica dell RNA Ogni nucleotide dell RNA neosintetizzato viene scelto secondo le regole di Watson e Crick di appaiamento delle basi; residui di uridilato (U) vengono inseriti nell RNA in posizione opposta ai residui di adenilato del DNA stampo. La RNA polimerasi non ha bisogno di un primer per iniziare la sintesi e non sono dotate di attività di correzione dei trascritti. L inizio avviene solo quando l RNA polimerasi si lega in corrispondenza di specifiche sequenze di DNA chiamate promotori. Il gruppo trifosfato in 5 del primo residuo di una catena nascente non viene scisso per liberare pirofosfato, ma resta intatto durante la trascrizione.

8 La trascrizione procariotica dell RNA Le RNA polimerasi DNA dipendenti sintetizzano RNA in direzione 5 3 utilizzando i quattro tipi di ribontp come precursori e copiando lo stampo di DNA.

9 La trascrizione procariotica dell RNA I problemi topologici determinati dalla trascrizione sono risolti grazie all azione delle topoisomerasi.

10 I filamenti senso e antisenso del DNA La composizione in basi della catena di RNA neosintetizzato è complementare a quella della catena stampo di DNA (filamento antisenso), ed esattamente simile a quella della catena codificante di DNA (filamento senso), fatta eccezione per la presenza dell uracile al posto della timina.

11 La trascrizione procariotica dell RNA La catena codificante di un determinato gene può essere situata su entrambi i filamenti di un cromosoma. Genoma dell adenovirus

12 L oloenzima RNA polimerasi

13 L RNA polimerasi di E. coli La RNA polimerasi diretta da DNA di E. coli èun enzima grande e complesso costituito da un nucleo di 5 subunità (α2ββ ω; Mr = ), e da una sesta subunità, chiamata σ. La subunità σ funziona solo per il riconoscimento del promotore e non è presente durante la fase di allungamento della trascrizione. Differenti tipi di σ riconoscono diverse sequenze regolatorie. Il sito attivo per la sintesi dell RNA è probabilmente costituito dalle subunità β e β. E anche presente una subunità ω di cui non è nota la funzione (in vitro non è necessaria per l attività dell enzima). Le RNA polimerasi non possiedono un attività di proofreading esonucleasica 3 5 (1 errore ogni ribonucleotidi incorporati nell RNA).

14 L RNA polimerasi di E. coli La RNA polimerasi si lega a specifiche sequenze del DNA chiamate promotori poste al 5 del gene. Sequenze di cinque promotori riconosciute dall oloenzima della RNA polimerasi contenente σ 70. L elemento UP, legato dalla subunità α dell RNA polimerasi, è presente solo in alcuni promotori e stimola fortemente la trascrizione del gene. Le RNA polimerasi sono capaci di individuare e trascrivere selettivamente i geni interagendo, con l ausilio di altre proteine (elementi trans), con siti specifici del DNA (elementi cis) presenti nella regione del promotore della trascrizione.

15 Promotori In funzione delle sequenze consenso presenti, i promotori differiscono molto per la loro efficacia. I geni i cui promotori mostrano sequenze di consenso altamente conservate, sono trascritti con elevata frequenza. Alcuni fattori trascrizionali di regolazione (attivatori o repressori) partecipano alla regolazione di questo processo.

16 Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori I promotori dei geni dei procarioti presentano due sequenze conservate a monte del sito di inizio della trascrizione. Queste due sequenze sono localizzate in una regione nota come nucleo del promotore, in posizione ben precisa rispetto al sito di inizio della trascrizione ( 10 e 35). Il primo nucleotide di DNA che viene trascritto in RNA èindicato come +1.

17 Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori La subunità σ contribuisce a determinare la specificità dell inizio della trascrizione. Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i siti promotori e diminuiscono di 10 4 volte l affinità della RNA polimerasi per regioni aspecifiche del DNA. La subunità σ permette alla RNA polimerasi di riconoscere la sequenza 5 TATAAT 3 della regione 10 e la regione 35 dei siti promotori. L oloenzima si lega al DNA a doppia catena e si sposta lungo la doppia elica in cerca di un promotore, formando legami idrogeno transitori. La ricerca è piùveloce perché l enzima scivola lungo il DNA invece di legarsi e separarsi ripetutamente.

18 La trascrizione procariotica dell RNA Una volta riconosciuto un elemento cis, la RNA polimerasi inizia la sintesi dell RNA ed è completamente processivo, per cui un trascritto completo viene sintetizzato da un unica RNA polimerasi. La sintesi dell RNA è la stessa sia in procarioti che in eucarioti, ma la regolazione del processo èmolto più complessa negli eucarioti. La sintesi dell RNA consta di tre fasi: inizio allungamento terminazione

19 Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i promotori E. coli contiene numerosi fattori σ, diversi tra loro, in grado di riconoscere vari tipi di sequenze di promotori presenti nel suo DNA. La subunità σ ha un ruolo fondamentale nella determinazione del punto dove la RNA polimerasi deve iniziare la trascrizione. La subunità σ presenta sulla sua superficie una struttura ad α elica, coinvolta nel riconoscimento della sequenza 5 TATAAT 3 della regione 10

20 Le subunità σ della RNA polimerasi riconoscono i promotori La subunità σ è dunque fondamentale perché aiuta la RNA polimerasi nella ricerca del sito di inizio della trascrizione. La sua dissociazione origina il nucleo dell enzima, ovvero la RNA polimerasi α2ββ cataliticamente attiva.

21 La trascrizione procariotica dell RNA Una volta avvenuto il riconoscimento delle specifiche sequenze consenso sul promotore, un tratto di DNA deve aprirsi in modo da funzionare da stampo molecolare. La transizione da complesso promotore chiuso a complesso promotore aperto segna l inizio della sintesi della catena di RNA. La regione che contiene la RNA polimerasi, il DNA e la molecola di RNA nascente è chiamata bolla di trascrizione.

22 La trascrizione procariotica dell RNA Nella bolla di trascrizione ( 17 bp), il filamento di RNA di nuova sintesi ibridizza con lo stampo di DNA. Contrariamente alla sintesi del DNA, la sintesi dell RNA può iniziare de novo in assenza cioè di un primer. La prima base aggiunta al 5 è pppg oppure pppa.

23 La trascrizione procariotica dell RNA Una volta iniziata la sintesi dell RNA, la RNA polimerasi si sposta unidirezionalmente lungo la catena stampo di DNA (filamento antisenso).

24 La trascrizione procariotica dell RNA Le RNA polimerasi DNA dipendenti sintetizzano RNA in direzione 5 3

25 Alla reazione di polimerizzazione partecipano due ioni metallici Dopo aver selezionato il corretto nucleotide trifosfato, l enzima catalizza la formazione del legame fosfodiesterico utilizzando ioni Mg 2+ quali cofattori.

26 Alla reazione di polimerizzazione partecipano due ioni metallici Dopo aver selezionato il corretto nucleotide trifosfato, l enzima catalizza la formazione del legame fosfodiesterico utilizzando ioni Mg 2+ quali cofattori.

27 Alcuni geni durante la trascrizione I precursori degli rrna vengono trascritti da più geni per l rrna. Si identificano chiaramente i siti di inizio e terminazione della trascrizione.

28 Terminazione della trascrizione Le regioni trascritte del DNA stampo contengono segnali di terminazione (o di stop). Uno dei più comuni è una regione palindromica ricca in GC seguita da una regione ricca in AT. Il risultato è la formazione di un trascritto che origina una struttura a forcina ( stem and loop ) seguita da una regione ricca in uridilato che causano la dissociazione dell elica ibrida DNA RNA.

29 Terminazione della trascrizione Con la dissociazione dell elica ibrida DNA RNA, il DNA si riavvolge e l RNA polimerasi lascia la doppia elica.

30 Terminazione della trascrizione In altri casi è necessario l intervento di fattori proteici (o attenuatori) per terminare la trascrizione, come ad esempio la proteina rho (ρ), una DNA RNA elicasi ad attività ATPasica che riconosce sequenze consenso localizzate sul trascritto in fase di sintesi. I terminatori ρ dipendenti non possiedono la sequenza di adenilati ripetuti nello stampo, ma di solito hanno una breve sequenza che porta alla formazione della forcina. La proteina ρ si associa all RNA in corrispondenza di un sito di legame specifico (sequenza ricca in GC) e migra in direzione 5 3 finché non raggiunge il complesso di trascrizione fermo al terminatore, e quindi contribuisce al rilascio del trascritto di RNA.

31 Terminazione della trascrizione L attività ATPasica di ρ permette alla proteina di tirare la catena di RNA in formazione, mentre insegue la RNA polimerasi. Quando ρ raggiunge la RNA polimerasi a livello della bolla di trascrizione, si ha la separazione dell elica ibrida RNA DNA; la proteina si comporta come una RNA DNA elicasi.

32 Modificazioni post trascrizionali degli RNA nei batteri A differenza degli eucarioti, gli RNA messaggeri dei batteri non subiscono significative modificazioni. Tuttavia, nei procarioti le molecole di RNA transfer e ribosomiale derivano da un processamento dei trascritti primari. Queste molecole si originano per azione di specifiche ribonucleasi su un unico trascritto primario di grosse dimensioni molecolari.

33 Modificazioni post trascrizionali degli RNA nei batteri Ulteriori modificazioni post trascrizionali possono riguardare sia le basi azotate che il ribosio.

34 La trascrizione dell RNA negli eucarioti Concetti chiave: Gli eucarioti utilizzano tre RNA polimerasi per la sintesi dell RNA diretta dal DNA. Le tre RNA polimerasi riconoscono sequenze del promotore diverse e, talvolta, altamente variabili. Un insieme dei fattori generali di trascrizione è necessario per iniziare la trascrizione negli eucarioti.

35 La trascrizione dell RNA negli eucarioti Negli eucarioti trascrizione e traduzione sono due processi spazialmente e temporalmente separati. Questo consente una più accurata regolazione del processo di espressione genica. A livello trascrizionale, la regolazione è controllata da diverse sequenze consenso presenti sui promotori e da numerosi elementi trans (fattori di trascrizione). A livello post trascrizionale, gli mrna eucarioti vanno incontro a estensive modificazioni (maturazione dei trascritti primari).

36 La trascrizione dell RNA negli eucarioti Differenze tra l inizio della trascrizione nei procarioti e negli eucarioti: Nei batteri vi è una RNA polimerasi, negli eucarioti tre. l RNA polimerasi batterica è in grado di iniziare la trascrizione senza l aiuto di altre proteine; le RNA polimerasicheeucarioticherichiedono l aiuto di altre proteine (Fattori trascrizionali). Le proteine che regolano la trascrizione negli eucarioti (repressori e attivatori) possono influenzare l inizio della trascrizione anche quando legate al DNA a grande distanza. Le sequenze regolative dei batteri sono vicine all inizio della trascrizione. Il DNA di una cellula eucariotica è organizzato nella cromatina.

37 Promotori delle RNA polimerasi eucariotiche Ciascuna RNA polimerasi eucariotica riconosce un gruppo di elementi promotori specifico.

38 Promotori della RNA polimerasi II Le sequenze consenso sul promotore della RNA polimerasi II sono localizzati sul versante 5 rispetto al punto di inizio della trascrizione. La sequenza più comune è la TATA box, localizzata a 25/30, molto simile alla sequenza di consenso più comune dei procarioti. Altri elementi sul promotore importanti per la trascrizione negli eucarioti sono la CAAT box e la GC box, la cui posizione a monte del punto di inizio della trascrizione può essere variabile.

39 Promotori eucariotici e procariotici a confronto

40 RNA polimerasi eucariotiche Il nucleo delle cellule eucariotiche contiene almeno tre tipi diversi di RNA polimerasi DNAdipendenti, tutte proteine omologhe simili alla RNA polimerasi batterica che hanno più subunità (8 14), cinque delle quali sono comuni a tutti gli enzimi. Ciascun tipo di RNA polimerasi eucariotica riconosce sul DNA promotori diversi per sequenza e posizione, e sintetizza specifici tipi di RNA. RNA Polimerasi I (localizzata nel nucleolo): RNA ribosomali (5.8S, 18S, 28S); 50 70% dell attività RNA polimerasica della cellula RNA Polimerasi II (localizzata nel nucleoplasma): RNA che codificano per le proteine (mrna) e alcuni piccoli RNA nucleari;(20 40% dell attività RNA polimerasica della cellula). RNA Polimerasi III (localizzata nel nucleoplasma): trna, RNA 5S e piccoli RNA nucleari (10% dell attività RNA polimerasica della cellula)

41 RNA polimerasi II L RNA polimerasi II eucariotica è un enzima costituito da 12 subunità. Le 3 subunità più grandi di Pol II presentano omologia con le subunità β, β e α dei batteri. La subunità maggiore di Pol II presenta alla propria estremità C terminale una serie di ripetizioni in tandem della sequenza YSPTSPS (52 nell uomo, 43 in Drosophila, 26 nel lievito), nota come sequenza CTD. RNA polimerasi di lievito PDBid 1I50

42 RNA polimerasi II La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizione degli mrna ed è quindi coinvolta nei processi di espressione genica. Per poter formare il complesso attivo della trascrizione richiede altre proteine, chiamate fattori di trascrizione. Attivatori Repressori Co attivatori Co repressori

43 I fattori generali di trascrizione eucariotici La RNA polimerasi II viene coadiuvata da un gruppo di elementi trans noti come fattori di trascrizione di base o generali (GTF). Sono comunemente indicati come TFII, transcription factors II, comprendente numerose proteine specifiche.

44 I fattori generali di trascrizione eucariotici In genere, l evento iniziale èil riconoscimento della TATA box ad opera di una TATA binding protein (TBP), proteina appartenente alla classe dei TFII. La TBP èil primo fattore trascrizionale che contatta il DNA. Durante la trascrizione proteine specifiche vengono reclutate in modo sequenziale. Si formano complessi macromolecolari sul DNA, essenziali per formare la bolla di trascrizione ed attivare la RNA polimerasi. Struttura di TBP legata al DNA

45 I fattori generali di trascrizione eucariotici La proteina TBP legata alla sequenza TATA box rappresenta il cuore del complesso di inizio. Il legame di TBP induce notevoli cambiamenti conformazionali nel DNA. La superficie a forma di sella della TBP contiene i siti di legame per altri componenti del complesso di inizio della trascrizione.

46 Diagramma di processo dell assemblaggio del complesso di preinizio

47 Diagramma di processo dell assemblaggio del complesso di preinizio

48 Gli inibitori della trascrizione L allungamento delle catene di RNA da parte della RNA polimerasi sia nei batteri che negli eucarioti viene inibito dall antibiotico actinomicina D e dall acridina. La porzione planare dell actinomicina D si inserisce nel DNA a doppia elica tra appaiamenti G Cconsecutivi e deforma il DNA.

49 Gli inibitori della trascrizione La rifampicina èun antibiotico che inibisce la sintesi di RNA legandosi specificamente alla subunità β delle RNA polimerasi batteriche e impedendo così la fase di distacco dal promotore.

50 Gli inibitori della trascrizione L α amanitina, un componente tossico del fungo velenoso Amanita phalloides, blocca la sintesi di RNA da parte della RNA polimerasi II, e, a concentrazioni più alte, della RNA polimerasi III. Non ha invece alcun effetto sulla trascrizione nei batteri.

51 La maturazione degli RNA negli eucarioti Negli eucarioti, i prodotti della trascrizione vanno incontro ad un processo di maturazione. Tutti i trascritti primari subiscono modificazioni post trascrizionali, ma sono gli RNA messaggeri a subire le modificazioni maggiori. Il processo di maturazione dell mrna comprende sia modificazioni a livello delle due estremità della molecola, sia lo splicing di segmenti del trascritto primario, un processo complicato che consente di eliminare segmenti corrispondenti alle sequenze introniche per formare mrna maturi pronti per la traduzione. La quasi totalità delle modificazioni posttrascrizionali a carico dei pre RNA hanno luogo nel nucleo della cellula.

52 La maturazione degli rrna negli eucarioti Il prodotto della RNA polimerasi I èun singolo precursore di grosse dimensioni molecolari, noto come pre rrna. Questo trascritto primario viene processato da numerosi fattori di maturazione (proteine e ribonucleoproteine) che vanno a costituire complessi macromolecolari, chiamati processomi, necessari per la maturazione del pre rrna. I nucleotidi vanno incontro a modificazioni, sia a livello delle basi che del ribosio. Il taglio enzimatico del precursore in tre rrna maturi rappresenta la fase finale del processo di maturazione.

53 La maturazione dei trna negli eucarioti I prodotti più importanti della RNA polimerasi III degli eucarioti, gli RNA transfer, subiscono rilevanti modificazioni post sintetiche. In particolare, una ribonucleasi specifica elimina la sequenza leader al 5 e l estremità 3 OH viene sostituita con la sequenza funzionale CCA. Mediante splicing viene rimossa una sequenza intronica per originare l ansa dell anticodone.

54 La maturazione dei trna negli eucarioti Inoltre, i trna eucariotici vengono modificati a livello delle basi e del ribosio come nel caso della pseudouridina.

55 La maturazione degli mrna negli eucarioti Il Pre mrna, prodotto della RNA polimerasi II, èil trascritto primario che negli eucarioti subisce le modificazioni maggiori. Oltre ad essere modificato ad entrambe le estremità 5 e 3, il pre mrna subisce il processo di splicing per rimuovere gli introni. I prodotti della maturazione sono trascritti contenenti un messaggio continuo, pronti a trasferire l informazione genetica per la fase della traduzione.

56 5 capping Come nei procarioti, anche l RNA messaggero degli eucarioti inizia con una A o con una G. Subito dopo la trascrizione, il gruppo trifosfato al 5 viene modificato con una molecola di GTP per formare un insolito legame fosfodiesterico 5 5. Questo motivo strutturale all estremità 5 è detto cappuccio (5 cap). Questa modifica dell estremità 5 conferisce stabilità alla molecola di mrna, proteggendola dalla degradazione causata da fosfatasi e nucleasi, ed inoltre aumenta l affinità del trascritto per i ribosomi.

57 Poliadenilazione dell RNA messaggero La quasi totalità degli RNA messaggeri eucariotici contiene una coda di poliadenilato, poli(a), aggiunta all estremità 3 OH dopo la trascrizione. Una specifica endonucleasi riconosce una sequenza di consenso sul trascritto e opera un taglio che attiva, a sua volta, una poli(a) polimerasi che catalizza l aggiunta di una sequenza di residui di adenilato all estremità 3. La coda di poli(a) può essere lunga anche nucleotidi. Come il cappuccio al 5, la coda di poli(a) aumenta la stabilità degli mrna e ne incrementa l efficienza traduzionale.

58 Splicing dell RNA messaggero Lo splicing èil meccanismo molecolare, estremamente preciso e selettivo, mediante il quale gli introni vengono rimossi. In tutti gli eucarioti le giunzioni introne esone nei trascritti primari presentano motivi strutturali comuni (siti di splicing). DNA Pre mrna mrna All interno degli introni, il sito di ramificazione contiene un altra sequenza invariante essenziale per un corretto processo di splicing.

59 Meccanismo dello splicing La chimica del processo di splicing è semplice e consiste in due reazioni consecutive di transesterificazione. 1. Il gruppo 2 OH di un residuo di adenilato al sito di ramificazione produce un attacco nucleofilo al sito di splicing 5, formando un legame fosfodiesterico atipico 2 5. Si genera un cosiddetto intermedio a forma di laccio. 2. Il gruppo 3 OH dell esone a monte può adesso attaccare il sito di splicing 3, legando gli esoni 1 e 2 tra di loro e liberando l introne.

60 Lo spliceosoma Il processo di splicing, sebbene semplice da un punto di vista chimico, richiede la cooperazione tra numerosi fattori. Piccoli RNA nucleari (snrna) si associano a proteine nucleari per formare snrnp (small nuclear RiboNucleoproteic Particles) che, in presenza di altri fattori di splicing, costituiscono il complesso dinamico macromolecolare 60S dello spliceosoma. Nello spliceosoma, l interazione che avvia il processo di splicing avviene tra il sito di splicing 5 di un trascritto di pre mrna ed uno snrna di tipo U1. Questa interazione è basata sulla formazione di doppie eliche intermolecolari di tipo RNA RNA tra sequenze conservate complementari tra di loro. I centri catalitici all interno dello spliceosoma sono costituiti esclusivamente da molecole di RNA. Gli snrna hanno pertanto un ruolo essenziale nel dirigere l allineamento dei siti di splicing e nei meccanismi catalitici (RNA catalitici). Transesterificazione I e II e rimozione dell introne

61 Meccanismo dello splicing

62 Autosplicing Un precursore dell RNA ribosomiale di Tetrahymena effettua un auto splicing in presenza del cofattore guanosina. Un introne è rilasciato nella prima reazione di splicing. Questo introne subisce quindi due reazioni di auto splicing per produrre un RNA lineare.

63 Trascrizione e maturazione sono processi accoppiati Nelle nostre cellule, trascrizione e maturazione degli mrna avvengono in modo sequenziale e coordinato. Dopo aver reclutato e attivato la RNA polimerasi II, il complesso basale della trascrizione, grazie all attività chinasica del fattore di trascrizione TFIIH, fosforila diversi residui localizzati sul dominio carbossi terminale (CTD) dell enzima. Il CTD fosforilato lega enzimi e fattori necessari per il 5 capping, lo splicing e la poliadenilazione, portandoli in prossimità dei loro siti di azione sul pre mrna ancora in fase di allungamento.

64 Splicing alternativo Lo splicing alternativo èun processo attraverso il quale più mrna possono essere generati dallo stesso pre mrna unendo in modo diverso gli esoni. Gli introni possono essere escissi in maniera diversa dando origine a proteine diverse o diverse forme di una stessa proteina. Lo splicing alternativo consente alle cellule degli organismi superiori di aumentare significativamente il numero delle proteine che possono essere codificate dal genoma.