Replicazione del DNA

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1 Replicazione del DNA Chimica della replicazione del DNA Enzimologia della replicazione del DNA Replicazione del DNA nei procarioti Replicazione del DNA negli eucarioti Replicazione alle estremità

2 Enzimi della replicazione del DNA In che modo le basi raggiungono la doppia elica che serve da stampo? La sintesi del DNA è catalizzata da un enzima chiamato DNA polimerasi

3 Replicazione del DNA Sia le cellule procariotiche che quelle eucariotiche contengono molteplici DNA polimerasi, ma solo alcuni di questi enzimi sono effettivamente coinvolti nella replicazione, mentre altri sono coinvolti in ruoli sussidiari nella replicazione e/o partecipano alla sintesi di riparazione Tutte le polimerasi hanno lo stesso tipo di attività sintetica Alcune funzionano in maniera indipendente, ma altre sono incorporate in grossi complessi proteici

4 Replicazione del DNA Le polimerasi di E. Coli I Enzima pola Gene Funzione Enzima di riparazione principale II polb Enzima di riparazione secondario III polc Replicasi IV dinb Riparazione SOS V umud 2 C Riparazione SOS

5 Replicazione del DNA Le polimerasi hanno spesso attività nucleasiche oltre alla capacità di sintetizzare DNA. Eso 3-5 Correzione di bozze (proofreading) Eso 5-3 Elimina piccoli gruppi di nucleotidi

6 Nick translation Questo evento può essere imitato bene in vitro con una reazione nota come nick translation Un nick (taglio) è un legame fosfodiesterico aperto in un DNA a doppio filamento. L esonucleasi 5-3 si attacca all estremità 5 dell apertura e demolisce la catena nucleotidica, mentre la DNA polimerasi, contemporaneamente, può legare nuovi nucleotidi all estremità OH in 3. L effetto finale è una migrazione del nick lungo il DNA

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8 DNA polimerasi I (DNA Pol I) Polipeptide di 103 kd costituito da 928 aa e presenta tre diverse attività enzimatiche: la polimerasi, l esonucleasi 3-5 che funziona da correttore di bozze, ed un attività esonucleasica 5-3 che attacca il DNA in forma di doppio filamento e ne stacca a partire dall estremità 5 un nucleotide dopo l altro (tale attività gioca un ruolo molto importante nei processi di riparazione del DNA) Trattamento proteolitico genera 2 frammenti 68kD (Klenow) Polimerasica 5-3 Eso kD eso5-3

9 Meccanismo d azione della DNA polimerasi Singolo sito attivo per catalizzare l aggiunta di tutti e quattro i nucleotidi Tiene conto dell identica geometria che caratterizza le coppie di basi A-T e G-C Selettività cinetica (coppie di basi non corrette portano ad una drastica diminuzione della velocità di polimerizzazione dovuto ad uno sfavorevole allineamento dei substrati) Distingue tra ribonucleotidi e desossiribonucleotidi

10 Struttura della DNA polimerasi Studi sulla struttura atomica di varie DNA polimerasi legate al complesso innesco-stampo hanno rivelato che il DNA substrato si pone in una fenditura che assomiglia ad una mano destra parzialmente chiusa. Per analogia i tre domini che formano la polimerasi vengono chiamati: pollice, dita e palmo

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12 Struttura della DNA polimerasi Il palmo è composto da un foglietto β e contiene gli elementi principali del sito catalitico Questa regione lega due ioni bivalenti ( Mg 2+ o Zn 2+ ) che modificano dal punto di vista chimico l ambiente attorno alle basi appaiate ed il 3 -OH dell innesco (uno riduce l affinità del 3 -OH per il suo idrogeno e l altro coordina le cariche negative dei fosfati β e γ del nucleotide e stabilizza il pirofosfato prodotto durante la formazone del legame innesco-nucleotide) Controlla l accuratezza dell accoppiamento delle basi che sono state polimerizzate formando dei legami idrogeno attraverso il solco minore della doppia elica neosintetizzata. Questi contatti dipendono solo dalla forma del nucleotide che permette un corretto appaiamento in base all ingombro sterico della coppia di basi che si forma. Appaiamenti scorretti riducono la velocità di polimerizzazione e l affinità per il DNA neosintetizzato

13 Struttura della DNA polimerasi Le dita sono anch esse importanti per la catalisi: Residui aa legano i dntp che devono essere polimerizzati Quando si forma una corretta coppia di basi fra lo stampo ed il nuovo nucleotide le dita si muovono per racchiudere e trattenere il dntp; questa forma più compatta stimola la catalisi spostando il nucleotide fino a porlo a stretto contatto con gli ioni bivalenti Le dita entrano in contatto con la regione dello stampo piegando di circa 90 il legame fosfodiesterico che si trova dopo il sito catalitico. Questa curvatura espone al sito attivo solo la prima base dello stampo che si trova dopo l innesco, eliminando qualsiasi confusione nella scelta del nucleotide che deve essere polimerizzato

14 Struttura della DNA polimerasi Il pollice non è direttamente coinvolto nella catalisi, ma interagisce con il DNA neosintetizzato. Questo serve a due scopi: Mantiene in corretta posizione l innesco ed il sito attivo Stabilizza il complesso fra la DNA polimerasi ed il substrato

15 Struttura della DNA polimerasi La catalisi della DNA polimerasi è un evento rapido, le DNA polimerasi sono in grado di polimerizzare circa 1000 nucleotidi al secondo Questo è dovuto alla natura processiva dell enzima La processività è la capacità di un enzima di eseguire cicli catalitici multipli con un singolo stampo invece di dissociarsi dopo ogni ciclo. Il grado di processività viene definito come il numero medio di nucleotidi polimerizzati nell unità di tempo L evento che limita l efficienza della processività è il legame con l innesco-stampo. Una volta che l enzima è legato, l aggiunta di nucleotidi diventa molto veloce Un ulteriore aumento della processività è reso possibile dall interazione della polimerasi con la proteina sliding clamp che ha la funzione di trascinare la polimerasi stessa

16 Attività esonucleasica della DNA polimerasi Durante la polimerizzazione possono verificarsi errori nell incorporazione dei nucleotidi (forma iminica ed enolica delle basi) Gli errori devono essere necessariamente rimossi e la possibilità di correzione del DNA neosintetizzato è mediata dalla presenza di nucleasi che rimuovono le basi scorrette Questo tipo di nucleasi è associato alla DNA polimerasi ed è conosciuto come esonucleasi correttore di bozze (proofreading exonuclease) Questo tipo di nucleasi è capace di demolire il DNA a partire dal terminale 3 (funziona come un sistema tasto di cancellazione della tastiera di un computer)

17 Attività esonucleasica della DNA polimerasi La rimozione dei nucleotidi errati è facilitata dalla ridotta capacità della DNA polimerasi di aggiungere nucleotidi ad una coppia di basi che non rispetta il principio della complementarità. Tratti di DNA non correttamente accoppiati alterano la geometria del 3 -OH, determinando una debole interazione tra il nucleotide ed il palmo, la velocità di reazione della catalisi diminuisce ed aumenta l affinità del filamento con il sito correttore di bozze La presenza dell attività esonucleasica di correzione di errori aumenta l accuratezza della sintesi del DNA (si passa da un errore ogni 10 5 nucleotidi ad un errore di ogni 10 7, tale percentuale di errore viene ancora abbassata dai processi di riparazione del DNA)

18 Specializzazione delle DNA polimerasi Per un efficiente e accurata replicazione del DNA è necessario che nella cellula vi siano DNA polimerasi diverse e specializzate. Ad esempio E. Coli possiede almeno 5 DNA polimerasi diverse che sono distinguibili per le loro attività enzimatiche, composizione in subunità e numero di molecole per cellula

19 DNA polimerasi I La DNA Pol I è formata da singoli domini e ciò può essere dimostrato dal trattamento di questo enzima con una proteasi (tripsina) che lo divide in una parte N-terminale più piccola che contiene l esonucleasi 5-3, ed una parte C-terminale, più grande, chiamata frammento di Klenow che porta la polimerasi e l esonucleasi 3-5 Tale polimerasi è specializzata nella rimozione degli RNA primer che vengono utilizzati per iniziare la sintesi del DNA La DNA PolI ha una minore processività, raggiunge i nucleotidi ogni volta che si posa sullo stampo. Queste proprietà sono ideali per la rimozione dell innesco e per la sintesi del DNA necessario a riempire l interruzione che tale rimozione ha determinato L azione nucleasica 5 può rimuovere il legame RNA-DNA che è resistente all RNAsi H

20 DNA polimerasi II La DNA polimerasi II è coinvolta nei processi di riparazione di danni al DNA

21 DNA polimerasi III La DNA Pol III è il principale enzima della replicazione: È altamente processivo Fa parte di un complesso chiamato DNA Pol III oloenzima, formato da molte subunità La più piccola forma funzionale prende il nome di Pol III core ed ha attività polimerasica ed esonucleasica 3-5, è presente come dimero e ciò ha molta importanza nella replicazione

22 DNA polimerasi eucariotiche Anche gli eucarioti posseggono più DNA polimerasi: una tipica cellula eucariotica ne possiede almeno 15. Di queste, tre sono essenziali per la duplicazione del genoma: la DNA Pol δ, DNA Pol ε e DNA α/primasi La DNA α/primasi è specializzata nell iniziare le nuove catene ed è composta da 4 subunità, due di queste hanno attività polimerasica e le altre hanno attività primasica. Dopo la sintesi dell innesco viene utilizzata l attività polimerasica A causa della relativa lentezza di questa operazione la DNA α/ primasi viene rimpiazzata dalle Pol δ e DNA Pol ε che sono altamente processive. Tale processo è detto switching delle polimerasi

23 La forca replicativa Nella cellula entrambi i filamenti vengono replicati contemporaneamente Il punto che si trova tra i due filamenti separati e la doppia elica che ancora non ha subito il processo di divisione è detto forca replicativa o forcella di replicazione La forca replicativa si sposta continuamente verso la parte del DNA non ancora denaturato, lasciandosi dietro due catene a singolo filamento su cui verranno sintetizzate due nuove catene di DNA La natura antiparallela della doppia elica crea una complicazione nella replicazione (replicazione discontinua); poiché il DNA è sintetizzato in 5-3, si distinguono due filamenti: leading strand (filamento continuo) e lagging strand (filamento ritardato)

24 La forca replicativa Sul filamento 3-5, la polimerasi si muove seguendo la forca replicativa ed il filamento sintetizzato di continuo prende il nome di filamento leading (leading strand) Sul filamento 5-3 la polimerasi dovrebbe muoversi in direzione opposta rispetto alla forca replicativa, il DNA sintetizzato su questo stampo prende il nome di filamento lagging o ritardato e viene sintetizzato (all indietro, cioè con la solita polarità 5-3 ) formando degli intermedi temporanei detti frammenti di Okazaki

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26 Topoisomerasi che rimuovono i superavvolgimenti che si accumulano a valle della forca replicativa Altri enzimi coinvolti nella replicazione DNA elicasi che catalizzano la separazione dei due filamenti. Esse sono proteine esameriche che assumono una conformazione ad anello e si legano e si spostano lungo il filamento di DNA. Possono avere una polarità 3-5 o 5-3 e sono altamente processive SSB (single stranded binding proteins) che stabilizzano le catene separate di DNA, si legano rapidamente al singolo filamento in modo cooperativo, ciò avviene perché la forza di legame aumenta con l aumentare del numero di molecole presenti. Il legame cooperativo assicura che una volta che il DNA a singolo filamento, creato dal passaggio delle elicasi venga ricoperto immediatamente dalle SSB; il DNA assume una forma distesa che facilita il suo ruolo di stampo

27 Altri enzimi coinvolti nella replicazione DNA sliding clamp (negli eucarioti PCNA) Composta da più subunità uguali fra loro che formano una struttura a ciambella. Il foro che si trova all interno della struttura è largo a sufficienza da abbracciare il doppio filamento di DNA più uno o due strati di molecole d acqua. Questa proteina che ricorda una pinza scivola lungo il DNA, senza mai dissociarsi da esso, mantenendo la DNA polimerasi fortemente associata alla forca replicativa. Quando si associa al DNA essa deve essere aperta. Uno speciale complesso proteico, detto posizionatore delle sliding clamp, catalizza l apertura ed il posizionamento della proteina sul DNA

28 Altri enzimi coinvolti nella replicazione Primasi (RNA polimerasi DNA dipendente), sintetizza il primer o innesco sotto forma di corti nucleotidi che vengono successivamente allungati dalla DNA polimerasi RNAsi H (Hybrid DNA-RNA) che rimuove la maggior parte di ciascun primer eccetto il ribonucleotide attaccato al nucleotide di inizio del DNA ( la rimozione crea un gap o interruzione che è un substrato ideale per la polimerasi) Dna ligasi catalizza la formazione del legame fosfodiesterico tra il fosfato in 5 ad una estremità ed il gruppo OH in 3 all altra estremità

29 Sintesi del DNA a livello della forca replicativa A livello della forca replicativa i filamenti leading e lagging sono sintetizzati simultaneamente. Ciò porta al vantaggio di limitare la quantità di DNA a singolo filamento presente nella cellula durante la replicazione Per coordinare la replicazione di entrambi i filamenti, molte DNA polimerasi lavorano a livello della forca replicativa. In E. Coli ciò è facilitato dal legame fisico che le tiene unite in un complesso multiproteico: DNA oloenzima La DNA Pol III oloenzima è costituita da due copie di DNA posizionatore della sliding clamp Le DNA polimerasi rimangono associate alla forca su entrambi i filamenti sfruttando la flessibilità della molecola di DNA

30 Sintesi del DNA a livello della forca replicativa Quando l elicasi apre la doppia elica in corrispondenza della forca replicativa, il filamento leading viene rapidamente copiato, mentre il lagging viene mantenuto a singolo filamento per effetto delle SSB. Ad intervalli di tempo regolari viene sintetizzato su questo filamento un innesco. Quando una polimerasi ha terminato di sintetizzare il frammento di Okazaki precedente, viene rilasciata dallo stampo pur rimanendo associata alla polimerasi che sta sintetizzando sul filamento leading

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33 Replicazione del DNA procariotico

34 Replicazione del DNA procariotico oric (origin of chromosomal replication) All interno di oric esistono 3 tipi di sequenze di DNA funzionalmente importanti: 1) Regione ricca in A/T; 2) Sequenze dnaa box (o scatola dnaa) 3) Siti GATC di metilazione

35 Replicazione del DNA procariotico Per dare avvio alla replicazione del DNA, le proteine DnaA si legano alle 4 dnaa box Le proteine DnaA e DnaC reclutano l elicasi (DnaB) in questa regione. L elicasi è costituita da 6 subunità, che formano un anello sui filamenti di DNA e migrano nella direzione 5 3. La primasi (detta anche primasi DnaG) e la proteina SSB si legano al DNA a singolo filamento, e vengono liberate le proteine DnaA

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37 Enzimologia della replicazione del DNA procariotico La DNA elicasi rompe i legami a idrogeno fra i filamenti di DNA Le topoisomerasi rilassano il superavvolgimento positivo Le proteine SSB mantengono i filamenti parentali in una condizione a singolo filamento La primasi sintetizza un innesco di RNA La DNA polimerasi (poliii) sintetizza un filamento figlio di DNA La DNA polimerasi (poli) idrolizza gli inneschi e colma le lacune con DNA La DNA ligasi unisce covalentemente i frammenti di DNA

38 Terminazione della replicazione del DNA procariotico Dalla parte opposta rispetto ad oric, il cromosoma di E. coli contiene un paio di sequenze di terminazione dette sequenze ter. Una proteina (ter-binding protein) si lega alle sequenze ter e arresta il movimento delle forcelle di replicazione. Una sequenza ter arresta il movimento della forca che si muove in senso orario, l altra quella che si muove in senso antiorario Interviene la DNA ligasi che lega tutte e quattro i filamenti di DNA creando due molecole circolari a doppio filamento (catenani) Le topoisomerasi producono una rottura temporanea nei filamenti di DNA e poi li riuniscono dopo che essi si sono separati in molecole circolari distinte

39 La replicazione del DNA procariotico è coordinata con il ciclo cellulare La replicazione del DNA avviene solo quando una cellula è in procinto di dividersi Il controllo della replicazione è nella fase di inizio a livello dell origine ed avviene in due modi: 1) regolando la concentrazione della proteina DnaA (per avviare la replicazione la concentrazione della DnaA deve diventare tanto alta da legare tutte le dnaa box e dopo la replicazione, tale proteina deve essere poco concentrata per impedire un nuovo ciclo prematuro di divisione)

40 La replicazione del DNA procariotico è coordinata con il ciclo cellulare 2) presenza di siti GATC all interno di oric. Questi siti possono essere metilati da un enzima noto come metilasi dam. Tale enzima riconosce i siti GATC, vi si lega e attacca un gruppo metilico sulla base adenina. Prima della replicazione tutti i siti sono metilati in entrambi i filamenti. Dopo la replicazione i nuovi filamenti non sono metilati. Il nuovo DNA non è in grado di replicarsi finché non è diventato completamente metilato.

41 La replicazione del DNA eucariotico La replicazione del DNA negli eucarioti non è conosciuta così bene come quella procariotica Molti studi hanno trovato analogie tra le caratteristiche generali (es. enzimi). Ciononostante, a livello molecolare, la replicazione del DNA nelle cellule eucariotiche sembra essere sostanzialmente più complessa (cromosomi lineari e più grandi, cromatina impacchettata in modo più compatto nei nucleosomi e regolazione del ciclo cellulare più complessa)

42 La replicazione del DNA eucariotico Origini di replicazione multiple (ARS) Sequenza simile alle dnaa box dei batteri che funziona da sito di riconoscimento per una proteina iniziatrice Complesso di sei proteine (ORC) che si lega all elemento ARS

43 La replicazione del DNA eucariotico Nelle cellule dei mammiferi sono presenti almeno 5 DNA polimerasi diverse Quattro di esse (α, β, δ ed ε) esercitano la loro funzione nel nucleo cellulare, mentre γ lavora nei mitocondri dove replica il DNA mitocondriale

44 La replicazione del DNA eucariotico Presenza degli istoni Mentre si svolge la replicazione del DNA, gli ottameri degli istoni rimangono attaccati ad uno dei filamenti del DNA parentale Sintesi degli istoni e del DNA durante la fase S del ciclo cellulare Replicazione alle estremità telomeriche

45 Telomeri e telomerasi: la fine della replicazione Presenza dei telomeri ad entrambe le estremità Telomero indica il complesso che comprende le sequenze telomeriche del DNA e le speciali proteine ad esso legate Le sequenze telomeriche sono rappresentate da una successione seriale moderatamente ripetitiva contenete parecchi nucleotidi G e T I telomeri hanno una forma di replicazione tutta speciale del DNA

46 Telomeri e telomerasi: la fine della replicazione 3 5 Fine del cromosoma Replicazione Rimozione dell RNA primer

47 Telomeri e telomerasi: la fine della replicazione Per impedire questa perdita di informazioni genetiche, le cellule eucariotiche attaccano sequenze aggiuntive di DNA alle estremità telomeriche Ciò avviene grazie all intervento di un particolare enzima che è la telomerasi La telomerasi riconosce le estremità telomeriche al 3 dei cromosomi e sintetizza ulteriori sequenze ripetute

48 Telomeri e telomerasi: la fine della replicazione La telomerasi è costituita da proteine ed RNA La parte dell enzima costituita da RNA contiene una sequenza complementare alla sequenza di DNA presente nella sequenza ripetuta telomerica. Ciò permette di legarsi all estremità del telomero Dopo il legame la sequenza di RNA funziona da stampo, permettendo la sintesi di una sequenza di sei nucleotidi Questo allungamento crea una regione non codificante che può essere sacrificata durante il processo di replicazione Nella specie umana la molecola di RNA è 3 -AAUCCC-5

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51 La telomerasi estende l estremita sporgente Quando e stato sintetizzato sufficiente DNA, puo essere innescato un nuovo Frammento di Okazaki