Replicazione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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1 Replicazione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

2 Replicazione Ciclo cellulare Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

3 Arthur Kornberg, 1970 Replicazione

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9 Giunzione innesco (primer) Stampo è fondamentale per la sintesi Replicazione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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15 L attivita delle DNA polimerasi 3' 1) Selettività Per 4 deossinucleoti 1000 volte 2) Verifica dell appaiamento ottimale 3) In caso di appaiamento errato riduzione velocità di incorporazione volte 5' 5'

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19 L attivita delle DNA polimerasi Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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25 Replicazione 1) Aggiunta occasionale di una forma tautomerica 2) Attività esonucleasica 3) Al 3 4) In media possiede una accuratezza 1 nucleotide non corretto ogni sintetizzati Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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29 Le tre DNA Polimerasi di E.coli 1) Pol I rimozione innesco riparo 2) Pol II riparo 3) Pol III Replicazione piccolo Chr altamente processiva 4) Pol IV Riparo 5) Pol V Riparo DNA Polimerasi I DNA Polimerasi II DNA Polimerasi III Struttura Dalton Composizione Numero/cellula 109,000 monomero ,000 monomero? >250,000 eteromultimero Attività enzimatiche Allungamento 5'-3' Esonucleasi 3'-5' Esonucleasi 5'-3' si si si si si no si si no Mutanti Loci mutanti Fenotipi dei mut. Letalità pola riparazione difet. vitalità ridotta solo quando difetta 5'-3' esonucleasi polb riparazione difet. senza effetto pplc, dnan, dnazx, dnaq, dbat previene replicazione letale condizionale

30 Eucarioti e procarioti

31 1) Più di 15 DNA polimerasi 2) Più subunità 3) Alfa 4 subunità 2 con polimemasi 2 con primasi Poco processiva Perciò rimpiazzata Da delta ed epsilon Switching Pol epsilon Filamento guida Pol delta Filamento discontinuo Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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35 1) DNA elicasi hanno diversa processività 2) Diversa polarità 5-3 o viceversa Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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37 1) A valle (+) superavvolg imenti Indotti dalla pol 2) Topo II Riduce il numero di legame topologico Ogni 20 bp(-2) Separazione di 10 nucleotidi provoca un aumento di 1 di superavvolgim enti (+) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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50 Proteina Funzione DNA polimerasi a DNA polimerasi d PCNA Fattore di replicazione C Fattore di replicazione A Topoisomerasi I e II MF1 (FEN I) DNA ligasi Innesco Sintesi del DNA Processività Allungamento Proteina SSB Separazione dei filamenti Rimozione dell RNA Saldatura delle incisioni Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

51 1) 0loenzima 2) Pol III 3) 3 copie 4) 2 Pol III core Complesso gamma Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

52 1) Caricatore Della pinza scorrevole Sliding clamp loader Aiuta ad aprire l anello del caricatore per avvolgere il DNA e posizionarlo utilizzando ATP Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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58 Fedeltà della replicazione Controllo presintetico Correzione di bozze

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60 Meccanismo di appaiamento delle 2 DNA polimerasi e simultanea sintesi del DNA sui 2 filamenti stampo Perché si impone la necessità di avere la sintesi simultanea dei 2 filamenti? Modello a trombone Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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68 Origine di Replicazione Sequenze ricche di AT si denaturano facilmente Modello del replicone Replicatore Sequenze che dirigono l inizio della replicazione Iniziatore Proteine che attivano l inizio della replicazione Legando specifiche sequenze Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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71 Origine di Replicazione Sito dove il DNA viene separato Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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74 Origine di Replicazione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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76 Replicatori ed iniziatori Poco conosciuti negli Eucarioti multicellulari 1) Iniziatore 2) Legano specifiche sequenze 3) Interagisco no con altri fattori 4) Possono piegare la regione del DNA Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

77 1) DNA A 2) DNA B=DNA elicasi 3) DNAC=proteina che carica la elicasi Origine di Replicazione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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82 Seq A lega il DNA emimetilato ed impedisce il legame di DNA-A Iniziatore Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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88 Origine di Replicazione Eucarioti 1) Origine di replicazione multiple 2) Mediamente sono separate ogni 30 kb (Chr 22 ha circa 10 origini) 3) Migliaia in quelli più grandi 4) Ciascuna origine deve essere replicata una sola volta 5) (deve essere inattivata fino al prossimo ciclo di divisione cellulare) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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90 Complesso pre-replicativo 1) Selezione del replicatore in G1 2) Attivazione dell origine in fase S 3) Formazione dei complessi pre-replicativi 4) Le molecole di DNA ancora non denaturate Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

91 1) In G1 si forma il complesso di pre-rc 1) Iniziatore ORC riconosce il replicatore 2) ORC recluta due caricatori delle elicasi (CDC6, CDT1) 3) Complesso Elicasi Mcm2-7 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

92 1) In S vengono attivate le chinasi Cdk e Ddk. Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

93 1) Dopo la fosforilazione del complesso arrivano in modo predeterminato 2) prima le Pol epsilon e delta poi le primasi Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

94 La terminazione della replicazione Sono diverse nei 1) Cromosomi circolari (è completa e generalmente le molecole figlie restano legate tra loro, concatenameri ) 2) Lineari ( non è completa perciò strategie diverse per superare il problema delle terminazioni libere) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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97 1) La richiesta di primer multipli determina l impossibilità a sintetizzare le estremità 2) Anche partendo dall ultimo nucleotide, la rimozione del primer crea un Gap Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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99 Telomeri Formati da T e G Il 3 dell estremità in queste regioni si estende oltre il 5 formando un tratto a singolo filamento Queste regioni reclutano la telomerasi Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

100 1) La telomerasi allunga il 3 OH ma non necessita di uno stampo esogeno ma utilizza un RNA che funge da stampo perciò il DNA di nuova sintesi è a singolo filamento 2) RNA telomerasi 3) TER utilizza come stampo un RNA (TERT) Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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102 1) La soluzione è quella di allungare l estremità attraverso delle proteine che fungono da stampo o da primer Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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104 Conservazione della lungezza dei telomeri Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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