Interazioni DNA-proteina

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1 Interazioni DNA-proteina

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3 Il dogma centrale della biologia Cell molecolare Transcription Translation Ribosome DNA mrna Polypeptide (protein) L informazione per la sintesi delle proteine è contenuta nel DNA. La trascrizione e la traduzione sono i processi attraverso cui l informazione genetica è convertita in proteine. Il flusso dell informazione genetica è unidirezionale, ovvero non passa mai dalle proteine agli acidi nucleici.

4 Trascrizione di RNA TRASCRIZIONE TRADUZIONE DNA RNA PROTEINA mrna rrna trna RNA messaggero (mrna) è lo stampo per la sintesi delle proteine RNA ribosomale (rrna) è il componente principale dei ribosomi RNA transfer (trna) è coinvolto nel processo di traduzione (trasporta amminoacidi in forma attivata sul ribosoma per la formazione di un legame peptidico)

5 RNA transfer (trna) RNA ribosomiale (rrna) RNA messaggero (mrna)

6 The Prokaryotic Need to understand the following: Transcription Apparatus Differenze tra replicazione e trascrizione Differenze tra DNA ed RNA polimerasi La RNA polimerasi di E. coli e la sua funzione Le sequenze che definiscono un promotore Gli step di inizio e di elongazione I due meccanismi di terminazione della trascrizione.

7 La trascrizione è molto simile alla replicazione per quanto riguarda: Meccanismo chimico Direzione di sintesi richiesta di uno stampo

8 La trascrizione differisce dalla replicazione perché: Non richiede un primer Interessa solo brevi segmenti della molecola di DNA Nel tratto trascritto, uno solo dei filamenti funge da stampo L inizio della trascrizione avviene a livello di sequenze specifiche (regione del promotore) riconosciute dalla RNA polimerasi

9 L RNA viene replicato dalle polimerasi Gli enzimi che catalizzano la reazione sono le RNA polimerasi Le RNA polimerasi richiedono: Uno stampo che generalmente è il DNA a doppia elica (ma anche a singola elica). L RNA non può essere utilizzato come stampo I substrati sono i NTP Mg 2+ e Mn 2+ La direzione di sintesi è 5 3 Le RNA polimerasi non richiedono innesco 3 -OH (primer)

10 A Simple Gene Transcription Start Site 5 Untranslated Region 5 Protein Coding Region 3 Promoter/ Control Region RNA Transcript 3 Untranslated Region Terminator Sequence Promotori - Sequenze di DNA che posizionano correttamente la RNAp rispetto al sito di inizio della trascrizione di un gene. Terminatori - Sequenze di DNA che specificano la terminazione della sintesi dell RNA ed inducono il rilascio della RNAp dal DNA. Reazione (ordered series of steps) 1) Inizio. 2) Elongazione. 3) Terminazione.

11 Importanti convenzioni di nomenclatura Sito di inizio della trascrizione 5 3 Upstream -5-4 Filamento stampo Downstream Direzione di trascrizione Non c è zero

12 Una sola delle due catene di DNA viene usata come stampo La catena di DNA che viene usata come stampo viene chiamata catena antisenso o non codificante. La catena di DNA che non funge da stampo viene chiamata catena senso o codificante

13 RNA polimerasi procariotica Permette il riconoscimento del promotore. Si dissocia dall oloenzima dopo l inizio della trascrizione Responsabile dell attività polimerasica 5 3 β' lega il DNA β lega i NTPs β e β ' costituiscono il sito attivo dell enzima α è essenziale per l assemblaggio e per l attivazione della RNAp da parte delle proteine regolative. σ riconosce sequenze promotrici sul DNA

14 Funzione del promotore: indica l inizio del gene che deve essere trascritto La trascrizione produce più copie dello stesso gene

15 Promotori La trascrizione inizia ai siti promotori che legano specificamente le RNA polimerasi

16 Proprietà dei Promotori I promotori consistono di una regione di 70 bp localizzata al 5 - del sito di inizio di trascrizione Sono presenti due elementi consenso: -La "-35 region", che possiede il consenso TTGACA -IL Pribnow box centrato a -10, che possiede il consenso TATAAT. Questa regione è ideale per lo svolgimento delle eliche.

17 Sequenze del filamento senso (codificante) di alcuni promotori di E.coli

18 Importanti caratteristiche di un promotore La forza del promotore è correlata alla maggiore o minore similutidine delle sequenze che sono localizzate a -10 ed a -35 rispetto al consensus Un promotore forte viene trascritto ogni due secondi, mentre uno debole viene trascritto ogni due minuti. La sequenza del tratto spacer (tra la regione -10 e a -35) non è importante The lunghezza della sequenza spacer IS è importante: TTGACA - spacer (16 to 19 base pairs) - TATAAT Spacers che sono più lunghi o più corti della lunghezza del consenso diminuiscono la forza del promotore.

19 INIZIO DELLA TRASCRIZIONE La RNAP si lega non specificamente al DNA e con bassa affinità e migra, alla ricerca di promotori. La subunità Sigma rende competente la RNAP a riconoscere le sequenze promotrici L oloenzima RNAP ed il promotore formano il complesso chiuso (DNA non svolto) La RNAP svolge il DNA di circa 17 coppie di basi per formare il complesso aperto La trascrizione ha inizio all interno del complesso aperto

20 Il processo di assemblaggio del core dell enzima α α 2 α 2 β α 2 ββ = core enzyme αι αιι β β CORE ENZYME L inizio della trascrizione è aspecifico e sequenza indipendente σ 70 vegetative (principal σ) + σ σ 60 SIGMA SUBUNIT intercambiabile, heat shock Preposta al nitrogen starvation (for emergencies) riconoscimento del (for emergencies) promotore

21 Elongazione Core polymerase - no sigma La RNAP è piuttosto accurata (only about 1 error in 10,000 bases -not as accurate as DNAP III) Tale frequenza di errore è compensata dal fatto che per ogni gene vengono prodotte diverse copie di trascritto La velocità di elongazione è di circa basi per secondo più lenta nelle regioni ricche in G/C-rich e più veloce in qualsiasi altra regione Le Topoisomerasi precedono and seguono la RNAP per rimuovere lo stress torsionale dovuto ai superavvolgimenti

22 L idrolisi del pirofosfato rende la reazione di sintesi dell RNA energeticamente favorita Ibrido DNA-RNA (eteroduplex)

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24 Le topoisomerasi rimuovono i superavvolgimenti L RNA polimerasi non ha attività esonucleasica e quindi non può effettuare proofreading Frequenza di errore: 1 ogni ribonucleotidi incorporati nell RNA Elevata processività

25 Transcripcion.flv

26 Terminazione Due meccanismi 1) Rho Il fattore di terminazione rho è una elicasi ATP-dependente Si muove lungo il trascritto, trova la struttura a bolla, svolge il DNA e rilascia la catena di RNA

27 Rho-Dependent Transcription Termination (depends on a protein AND a DNA sequence) G/C -rich site RNAP rallenta Rho elicase raggiunge la RNAP Il complesso di elongazione si disassembla

28 Terminazione Two mechanisms 2) Rho-Independent - I siti di terminazione si trovano sul DNA Sequenza ripetuta ed invertita, ricca in GC che forma una struttura stem and loop sul trascritto di RNA 6-8 A sono localizzate sul filamento coding e producono un numero corrispondente di U sul trascritto.

29 Terminazione della Transcrizione Rho- Independent (dipende dalla sequenza di DNA - NON da un fattore proteico) Stem-loop structure

30 Rho-independent transcription termination RNAP si arresta quando raggiunge un sito di terminazione. La pausa della RNAP consente alla struttura ad hairpin di formarsi La struttura ad Hairpin distrugge importanti interazioni tra RNAP ed il suo prodotto ad RNA L RNA U-rich può dissociare dal templato Il complesso è distrutto e l elongazione è terminata

31 La RNA Polymerase è un enzima spettacolare Effettua lo scanning delle sequenze di DNA ed identifica promotori Si lega ai promotori Inizia la trascrizione: non richiede un primer Allunga la catena di RNA Effettua la terminazione della trascrizione Interagisce con attivatori e repressori

32 La regolazione trascrizionale in Prokaryotes Perchè è necessaria? L ambiente cambia rapidamente La sopravvivenza dipende dalla capacità di adattarsi I batteri devono esprimere gli enzimi richiesti per sopravvivere in quell ambiente La sintesi di enzimi ha un costo energetico elevato. Dunque gli enzimi devono essere prodotti solo quando è necessario.

33 Proteins Costitutive Sono sempre espresse housekeeping e.g. glucose metabolizing enzymes: il glucosio è la fonte di carbonio più utilizzata Adaptive inducible Sono prodotte solo quando è necessario: e.g. Lactose metabolizing enzymes Sono prodotte solo se il lattosio è la sola fonte di carbonio: Non sono infatti prodotte se il glucosio è presente.

34 Ways to Regulate Transcription 1. Uso di fattori sigma alternativi : controllano la trascrizione selettiva di interi gruppi di geni vegetative (principal s) σ 70 TTGACA +1 (16-19 bp) TATAAT (5-9 bp) A heat shock σ 32 CNCTTGA +1 (13-15 bp) CCCATNT (5-9 bp) A nitrogen starvation σ 60 CTGGNA +1 (6 bp) TTGCA (5-9 bp) A

35 Ways to Regulate Transcription 2 Regolazione Positiva (attivazione): un fattore di regolazione positiva migliora la capacità della RNAP di interagire in corrispondenza del promotore e di iniziare la trascrizione a livello di un promotore debole Activator RNAP Activator binding site EXAMPLE: CAP

36 Ways to Regulate Transcription 3. Regolazione negativa (repressione): un fattore di regolazione negativa (repressore) inibisce la capacità di RNAP di interagire con un promotore forte ed iniziare la sintesi di RNA RNAP Repressor Operator EXAMPLE: lac REPRESSOR

37 Come avviene la trascrizione negli Eucarioti?... Negli Eucarioti sono presenti TRE tipi di RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I) RNA polimerasi II (Pol II) RNA polimerasi III (Pol III) sintesi di RNA pre-ribosomiale (un unico trascritto contenente i precursori di rrna 18S, 5.8S, 28S) sintesi degli mrna sintesi dei trna, rrna 5S piccoli RNA

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39 Differences Between Transcription In Prokaryotes and Eukaryotes

40 Transcription And Translation In Prokaryotes RNA Pol. 5 Ribosome 5 mrna Ribosome

41 Eukaryotic Transcription DNA Nuclear pores Cytoplasm RNA Transcription RNA Processing mrna G Nucleus AAAAAA Export G AAAAAA

42 promotore Fattori di trascrizione (TF) proteine che regolano la trascrizione, ma non sono subunità della RNA polimerasi di inizio

43 Modificazioni post-trascrizionali degli mrna eucariotici (maturazione degli mrna) Aggiunto prima che la sintesi del trascritto primario sia completata Introni = sequenze non codificanti (eliminati con lo splicing) Esoni = sequenze codificanti

44 -guanililtransferasi (nucleo) da GTP -guanina 7-metiltransferasi (citoplasma) cappuccio 5 : - Protegge l mrna dalle ribonucleasi - Viene riconosciuta da proteine che legano il ribosoma Coda di polia ( nucleotidi) Aggiunta dalla poliadenilato polimerasi (nucleo) Stabilizza l mrna Ne favorisce l uscita dal nucleo

45 SPLICING: eliminazione degli introni snrnp = piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (proteine + snrna) Splicing alternativo

46 VuAwBGw_pQ mrna Splicing.flv