Trascrizione negli Eucariotici

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1 Trascrizione negli Eucariotici Cytoplasm DNA RNA Transcription RNA Processing mrna G Nucleus AAAAAA Export G AAAAAA

2 CLASSI DI GENI Le unità di trascrizione eucariotiche sono più complesse di quelle procariotiche per l esistenza di 3 sistemi distinti di trascrizione (esistono tre distinte RNA polimerasi) GENI DI CLASSE I: codificano per gli rrna 5,8S, 18S e 28S e sono trascritti dall RNA POLIMERASI I. GENI DI CLASSE II: codificano per tutti gli mrna, una grande varietà di snrna e sono trascritti dall RNA POLIMERASI II. GENI DI CLASSE III: codificano per gli rrna 5S, per i trna e alcuni scrna e sono trascritti dall RNA POLIMERASI III.

3 TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Le RNA polimerasi eucariotiche non sono in grado di avviare il processo di trascrizione ma necessitano di fattori di trascrizione ausiliari che riconoscono le sequenze a livello del promotore. I promotori si trovano solitamente a monte del sito d inizio (RNA pol. I e II), ma talvolta anche a valle dello stesso (RNA pol III). RNA pol. I e III riconoscono una serie ristretta di promotori e si servono di un numero limitato di fattori di trascrizione. RNA pol. II riconosce una gamma più vasta di promotori e pertanto utilizza un numero di fattori molto più vasto. Tali fattori si possono suddividere in:

4 RNA POLIMERASI EUCARIOTICHE: RNA POLIMERASI I, II, III Sono proteine formate da numerose subunità (8-14) Hanno notevoli dimensioni (500 Kd o più) Solo in S. cerevisiae sono state definite a livello genico tutte le subunità; sono necessarie subunità per la trascrizione.

5 Le subunità più grandi hanno omologia con le subunità dell RNA polimerasi batterica e portano probabilmente il sito catalitico.

6 PROMOTORE DELL RNA POLIMERASI I Esibiscono una scarsa variabilità e sono bipartiti. UPE (Upstream Promotor Element) Posizione -180/ NUCLEO DEL PROMOTORE Posizione -45/+20 ricco in G. C tranne nella regione vicina al punto di inizio chiamata Inr ricca ina. T Fattori : UBF1: si lega ad entrambe le regioni; prima alle sequenze ricche di G-C dell UPE. Il fattore porta il DNA ad avvolgersi intorno alla superficie della proteina facendogli compiere un giro di 360 e rende così il nucleo e l UPE molto vicini tra loro, favorendo il legame di SL1 che lega il nucleo del promotore. Ha una funzione simile alla subunità sigma procariotica. È formato da 4 proteine di cui una è TBP (necessaria anche alle altre polimerasi).tbp: fattore di posizionamento. Associato ad altre proteine specifiche per ciascun promotore, assicura che l RNA polimerasi si localizzi nel punto d inizio della trascrizione.

7 I fattori di trascrizione: UBF1 (upstream binding factor) lega due sequenze specifiche del promotore; SL1 si lega al complesso

8 I geni per gli rrna-eucariotici cluster di geni ripetuti

9 Trascrizione dei geni per l rrna

10 PROMOTORI DELL RNA POLIMERASI III Si suddividono in due classi che prevedono fattori di trascrizione differenti in base al tipo di RNA che viene trascritto: rrna 5S e trna promotori interni snrna promotori a monte del sito d inizio

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12 I PROMOTORI INTERNI SI DIVIDONO IN 2 TIPI, CIASCUNO CON UNA STRUTTURA BIPARTITA: I promotori possono consistere in: sequenze bipartite a valle del punto d inizio, con boxa separata da boxb o da boxc. sequenze separate, a monte del punto d inizio (OCT, PSE, TATA).

13 PROMOTORI INTERNI L RNA Pol. III richiede fattori di assemblaggio rappresentati da TFIIIA e TFIIIC e il fattore d inizio TFIIIB. TFIIIB è il fattore di posizionamento che contiene TBP.

14 PROMOTORI A MONTE Esistono 3 elementi a monte: TATA conferisce la specificità di legame per il tipo di polimerasi ed è l elemento essenziale per l inizio della trascrizione (ad esso si lega un fattore che comprende TBP). PSE e OCT incrementano ulteriormente l efficienza della trascrizione.

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16 Un gene che codifica per una proteina oltre ai siti di riconoscimento per l inizio della trascrizione può possedere un grande assortimento di sequenze di DNA coinvolte nella regolazione della trascrizione. Queste sequenze vengono definite elementi di regolazione e possono essere localizzate sia a monte sia a valle del punto d inizio della trascrizione dell RNA. Questi elementi regolatori possono legare dei fattori trascrizionali specifici, cioè proteine coinvolte nell attivazione o nella repressione della trascrizione di un gene (attivatori e repressori). Gli elementi regolatori in posizione più distale sono chiamati enhancers e sono necessari per ottenere il massimo grado di trascrizione per un dato gene.

17 Altri fattori che stimolano l evento iniziale: ENHANCER: elementi regolativi che si trovano molto distanti dal sito d inizio (anche parecchie Kb), sia a monte che a valle e in qualsiasi orientamento. Sono bersagli di regolazioni temporali o tessuto-specifiche e non sono specifici solo per l RNA pol. II ma anche per la RNA pol. I. IL DNA può ripiegarsi e fare in modo che i fattori di trascrizione a livello di promotore ed enhancer interagiscano tra loro per formare un grosso complesso proteico.

18 Il promotore di un gene eucariotico è organizzato in una serie di elementi promotori, o moduli promotori. Partendo da quello più vicino al sito d inizio di trascrizione, gli elementi promotori sono il TATA box,il CAAT box e il GC box. Gli elementi sono chiamati così per le sequenze generali di basi di DNA che contengono. Gli elementi promotori sono fondamentali per la regolazione dell espressione genica.

19 La struttura dei promotori trascritti dalla Pol II

20 PROMOTORI DELL RNA POLIMERASI II ~200 bp gene

21 RNAP II BRE TATA ~24bp Inr DPE TATA-box BRE 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

22 TFIIE TFIIF 2 subunits TFIIA 2-3 subunits 2 subunits TFIID RNAP II 12 subunits TFIIB 10 subunits 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits TFIIH

23 TFIIE TFIIF 2 subunits TFIIA 2-3 subunits 2 subunits TFIID RNAP II 12 subunits TFIIB 10 subunits 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits TFIIH

24 RNAP II BRE TATA ~24bp Inr DPE TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr DPE lega TFIID

25 TFIIA TFIID TFIIB TFIIF BRE TATA Inr DPE ~24bp TFIIE RNAP II

26 TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TFIID TBP

27 PROTEINA TBP Si lega al DNA a livello del solco minore attraverso contatti specifici con il DNA. N- terminale variabile Dominio conservato Doppia elica del DNA Dominio conservato

28 Il legame di TBP al DNA nella regione compresa tra -40 e il punto d inizio determina un ripiegamento a livello della TATA box, permettendo ai fattori di trascrizione e all RNA polimerasi di formare una stretta associazione

29 TFIID e composta da vari TBP Associated Factors TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

30 TFIID BRE TATA Inr DPE ~24bp

31 TFIIA TFIIA TFIID BRE TATA Inr DPE ~24bp -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

32 TFIIB TFIIA TFIID TFIIB BRE TATA Inr DPE ~24bp -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d inizio e Stabilisce la direzione

33 TFIIF TFIIA TFIID TFIIB TFIIF BRE TATA Inr DPE ~24bp RNAP II Stabilizza il complesso di preinizio e induce una torsione nel DNA

34 TFIIE TFIIA TFIID TFIIB TFIIF BRE TATA Inr DPE ~24bp TFIIE RNAP II Attira una elicasi ed insieme srotolano il promotore. Stimola l attivita chinasica di TFIIH

35 TFIIH TFIIA TFIID TFIIB TFIIF BRE TATA Inr DPE ~24bp TFIIE RNAP II Fosforila una delle subunita della polimerasi dando l avvio alla trascrizione

36 Le RNA Polimerasi sono posizionate a livello di tutti i promotori da un fattore che contiene TBP.

37 Meccanismi di terminazione della trascrizione negli eucarioti RNA polymerasi I termina la trascrizione attraverso un meccanismo che richiede un fattore di terminazione polimerasi-specifico, che si lega a valle dell unità di trascrizione RNA polymerasi II termina la trascrizione in una regione posta kb a valle del sito di poliadenilazione grazie ad un meccanismo che accoppia il taglio del pre-mrna e la sua poliadenilazione all estremità 3 RNA polymerasi III termina la trascrizione dopo aver polimerizzato una serie di residui U