Il Dogma Centrale della Biologia

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1 Il Dogma Centrale della Biologia

2 TRASCRIZIONE DEL DNA, TRADUZIONE DELL RNA

3 TRASCRIZIONE DEL DNA, TRADUZIONE DELL RNA L espressione dell informazione genica segue il PRINCIPIO DI COLINEARITA

4 ESPRESSIONE GENICA Solo una frazione minore del DNA presente nelle cellule viene trascritta ed e codificante Evidenze recenti riportano che oltre la meta del genoma possa essere trascritto A seconda delle loro necessita, le cellule trascrivono specifici segmenti del DNA genomico (I GENI), sintetizzando molecole di RNA che hanno la stessa sequenza dei segmenti trascritti Parte di questi RNA e codificante per proteine, cioe e in grado di specificare la sequenza amminoacidica di una data proteina negli Eucarioti, gli RNA codificanti, prima di essere tradotti, vengono modificati (trascritto primario -> trascritto maturo) altri RNA hanno ruolo funzionale e non sono codificanti

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6 TRASCRIZIONE Viene trascritto solo uno dei due strand

7 TRASCRIZIONE - BATTERI

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9 TRASCRIZIONE 1) INIZIO DELLA TRASCRIZIONE Il promotore indica alla polimerasi: dove iniziare la trascrizione quale filamento leggere la direzione da prendere

10 TRASCRIZIONE 2) ALLUNGAMENTO DEL TRASCRITTO 3) TERMINAZIONE

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12 Terminazione della trascr. - Palidromi/forcine I segnali di terminazione sono nella sequenza di DNA, ma espletano la loro funzione solo quando sono trascritti in mrna Inducono l RNA di nuova sintesi ad assumere una struttura secondaria (generalmente delle forcine di terminazione) tale da far staccare la polimerasi

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17 GLI ENZIMI DELLA TRASCRIZIONE EUCARIOTICI L enzima che sintetizza RNA copiando DNA e una RNA polimerasi DNA-dipendente. Negli Eucarioti esistono tre diverse RNA polimerasi, che trascrivono categorie distinte di geni: RNA polimerasi I -> rrna 28S, 18S, 5,8S RNA polimerasi II -> RNA cod. polipeptidi, snrna, mirna RNA polimerasi III -> rrna 5S, trna, + altri piccoli RNA L enzima RNA polimerasi trascrive il DNA ma non e in grado, da sola, di iniziare il processo di trascrizione, ne di scegliere l esatto sito d inizio della trascrizione (TSS)

18 promotore L iniziazione ad un promotore eucariotico coinvolge un gran numero di fattori che si legano a diversi cisacting elements. promotore è definito come la regione di DNA che contiene tutti questi siti di legame, cioè che inizia la trascrizione con efficienza normale e controllo appropriato

19 Sequenze consenso di RNA Sequenze consenso trovate i prossimità dello start point di Pol II. Di solito ne sono presenti 2 o 3 La più comune è TATAbox Quattro siti canonici del promotore di base (core promoter): BRE (lega TFIIB) TATA (Lega TBP) INR (Iniziatore) DPE (Downstream promoter element pol II

20 Inizio della trascrizione in eucarioti: pol II La trascrizione negli eucarioti è più complessa perché il DNA è compattato nella cromatina e nucleosomi. Per iniziare la trascrizione le pol eucariotiche necessitano l aiuto di un gran numero di proteine general Transcription factors (GTF). Quelli di pol II sono TFII TATA binding protein (TBP) è parte di TFIID

21 The basal apparatus assembles at the promoter Binding of TF II D to the TATA box is the first step in initiation. Other transcription factors bind to the complex in a defined order, extending the length of the protected region on DNA. When RNA polymerase II binds to the complex, it initiates transcription.

22 ESPRESSIONE GENICA - PROMOTORI La regione di DNA prossimale alla parte trascritta del gene (promotore) contiene una serie di sequenze segnale che vengono riconosciute da specifici fattori di trascrizione che interagiscono con l RNA polimerasi, permettendone il corretto posizionamento e favorendo l inizio della trascrizione. I promotori per la RNA polimerasi II generalmente comprendono: uno o piu dei seguenti elementi di sequenza riconosciuti da fattori di trascrizione generali: TATA box, seq. TATAAA, -25 al TSS, determina il TSS GC box, seq. GGGCGG, presente in geni housekeeping CAAT box, -80 al TSS, influenza il livello di trascrizione Altri elementi di sequenza riconosciuti da fattori di trascrizione tessuto-specifici, ad es.: CRE (elemento di risposa al camp), seq. GTGACGT(A/C)A(A/G)

23 Altri fattori di trascrizione TAF: TBP si associa a circa 10 TAF diversi per legare il promotore, ed altro TFIIB: proteina a singola catena che entra nel complesso dopo TBP TFIIF il suo legame con Pol II è necesario per reclutare TFIIE e TFIIH TFIIE- TFIIH. TFIIE recluta TFIIH. Questo è molto grosso (9 subunità) induce la formazione del complesso aperto, coinvolta nel mismatch repair

24 TATA-Binding protein(tbp) TBP è una subunità di TFIID. E fatto da due domini simili. Lega TATA box e ripiega il DNA dando così un segnale agli altri general TF TF II D, è fatto da TBP e 11 TAFs (TBP associated factor), con una massa totale di ~800 kd TBP lega il DNA nella minor groove, con un dominio beta. Lo distorce ed allarga il solco minore-

25 TBP binds DNA in an unusual way TBP si lega alla TATA box nel minor groove of DNA. Forma una sella intorno al DNA e lo piega di ~80. Alcune TAFs somigliano agli istoni e potrebbero formare strutture simili all ottamero degli istoni

26 promotori ed enhancers Il basal factors insieme alla RNA polimerase fanno il basal transcription apparatus. Le sequenze riconosciute dai TF sono a monte del startpoint. Le sequenze dei promotori sono vicini allo startpoint e sono necessarie per l inizio. Gli enhancer sono sequenze che stimolano l inizio, ma sono localizzate a distanza dello startpoint.

27 Inizio della trascrizione in eucarioti Trascriptional activators aiutano l inizio della trascrizione Il mediatore aiuta a comunicare activators con pol II e general TF La RNA polimerasi si associa ad elongating factors

28 Il mediatore È composta da varie subunità > 20 alcune conservate nelle diverse specie La composizione del mediatore potrebbe essere variabile È stato isolato il mediatore legato alla PolI ed altri TF. Questo sarebbe RNA PolII oloenzima

29 Fattori che stimolano l allungamento e la correzione Nell allungamento la PolII si libera di molti TF e recluta fattori di allungamento (TFIIS e hspt5) TFIIS stimola l allungamento e facilita la correzione

30 Fattori per la maturazione e processamento del RNA La CTD fosforilata recluta gli enzimi per il capping e per lo splicing Il capping viene effettuato subito dopo la sua sintesi

31 Gli enzimi per il processamento del DNA sono portati dalla coda CTD della RNA Pol II. RNA factory

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33 RNA capping Fosfatasi Guanil transferasi Tre enzimi: Fosfatasi Guanil transferasi Metil transferasi Metil transferasi

34 3 terminale di mrna eucariotici Sequenze consenso AAUAAA è riconosciuta da cleavage and polyadenylation specific factor (CPSF) La regione GU-rich da Cleavage stimulation factor F (CstF)

35 Produzione del 3 terminale di mrna eucariotici La sequenza AUAAA è riconosciuta da CPSF, la GU-rich da CstF, poi reclutano altri fattori che tagliano il DNA e viene reclutata poli- A-polimerasi (PAP)

36 RNA Processing Esoni introni: esempi di due geni umani

37 Lo splicing

38 Esempi di splicing alternativo

39 Figure 6-26a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

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41 Sequenze consenso per gli introni

42 Figure 6-26a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

43 Consensus sequence Un alte conservazione si trova solo immediatamente all interno degli introni alle giunzioni presunte. Questo identifica la sequenze di un introne generico come la regola : GU##AG: o GT-AG. I due siti hanno sequenze diverse e definiscono le terminazione degli introni direzionalmente.

44 ESISTONO QUATTRO CLASSI DI INTRONI : INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO I INTRONI Self-Splicing DI GRUPPO II INTRONI DI RNA NUCLEARE BERSAGLIO DELL APPARATO DI SPLICING (Spliceosomal Introns) INTRONI trna Nucleare che subiscono matutrazione per via enzymatica

45 Tom Cech Sidney Altman Tom Cech e Sidney Altman hanno ricevuto il premio Nobel per la Chimica ne 1989 per la scoperta del meccanismo di self splicing in Tetrahymena e per la scoperta che la componente catalitica della ribonucleasi P responsabile per la maturazioen del trna in E.coli era una molecola di RNA.

46 introni Self-splicing di gruppo I. Rari introni di eucarioti, rrna o organelli. Dimensione di nt Hanno una sequenza di guida interna che si appaia alla sequenza del sito al 5. Lo splicing non necessita della presenza di proteine

47 introni Self-splicing di gruppo II. Rari introni di organelli. Dimensione di nt Lo splicing non necessita della presenza di proteine Il meccanismo è simile a quello dello spliceosoma

48 MECCANISMO DI EXCISIONE INTRONI DI TIPO II 1 reazione di transesterificazione promossa da C 2 adenosina Rottura legame fosfodiestereo Formazione nuovo legame 5-2 che lega primo nt con adenosina interna Formazione del lariate e riformazione del legame fosfodiestereo

49 IN CONCLUSIONE LE DIFFERENZE TRA INTRONI DI GRUPPO I E II SONO: L AGENTE RESPONSABILE DELL ATTACCO NUCLEOFILO INIZIALE.

50 IN CONCLUSIONE LE DIFFERENZE TRA INTRONI DI GRUPPO I E II SONO: L AGENTE RESPONSABILE DELL ATTACCO NUCLEOFILO INIZIALE.

51 Spliceosomal Intron Splicing I passaggi di base necessari per la maturazione di RNA-trascritto primario in eucariote sono gli stessi visti per il gruppo II di introni self-slicing e i prodotti di reazione anche in questo caso sono l RNA maturato correttamente e un lariate. A differenza degli introni self-splicing la reazione in eucariote richiede la partecipazione di un sistema elaborato di altri fattori quali le small nuclear ribonucleoprotein particles or snrnps. Ogni snrnp è un complesso di diverse proteine e piccoli U-RNA detti small nuclear RNA or snrna. Gli snrna coinvolti nello splicing sono cinque

52 Particelle dello splicing - SnRNPs (Small nuclear ribonuclear proteins) binds critical sites on the pre-mrna - pronounced SNURPs - these are complexes containing both protein and small RNAs - the small RNAs are transcribed by RNA polymerase III - they then associate with accessory proteins - the complex then recognizes critical sites for splicing by base pairing

53 Gli snrnas sono necessari per lo splicing I cinque snrnps coinvolti nello splicing sono U1, U2, U5, U4, e U6. Insieme ad altre proteine addizionali, gli snrnps formano lo spliceosome. Tra esse: U2AF (U2 Auxillary Factors) e BBP (branch point Binding Proteins). Le proteine agiscono in modo coordinato con la formazione di tre complessi intermedi

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55 spliceosoma Il complesso si assembla sequenzialmente sul premrna, e lo splicing avviene solo dopo che tutti i componenti si sono assemblati Il nucleo e il citoplasma contengono molti piccoli RNA ( bp) Quelli nel nucleo sono chiamati small nuclear RNAs (snrna); e quelli nel citoplasma small cytoplasmic RNAs (scrna). lo spliceosome include un 50-60S ribonucleoprotein particle (più grande di quella del ribosoma), con 150 proteine

56 Meccanismo dello splicing La giunzione a tre vie del cappio

57 Il meccanismo dello splicing Attacco del 2 OH al 5 splicing site con formazione del cappio Attacco del 3 OH libero al 3 splicing site Liberazione del cappio

58 E A B C RNA splicing Passaggi dello spliceosoma Complesso E (early) A: (Branch site) B1: (spliceosoma completo) B2: U1 è rilasciato e si ha un riarrangiamento C1: U4 è rilasciato ed inizia la catalisi C2: sito 3 tagliato e gli esoni ligati animazione

59 Accoppiamento RNA-RNA Il sito al 5 è riconosciuto prima da U1 e poi da U6. U6 e U2 indirizzano la catalisi.

60 IL 15% DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI CHE CAUSANO MALATTIE GENETICHE NELL UOMO E A CARICO DELLO SPLICING. Malattie causate da difetti nel meccanismo di splicing: Sindrome di Frasier (difetti nello sviluppo di rene e gonadi) Distrofia miotonica Retinite pigmentosa Fibrosi cistica atipica Atrofia muscolare spinale Alcuni tipi di tumore

61 The Survival of Motor Neuron (SMN) Gene Spinal Muscular Atrophy is caused by mutations in the SMN gene SMN gene located on chromosome 5 Autosomal recessive gene Gene codes for the SMN protein 3

62 Survival of Motor Neuron Protein Most SMN proteins are localized in the cytoplasm They play a crucial role in the assembly of spliceosomal uridine-rich small nuclear ribonucleoprotein (U snrnp) complexes snrnps are essential to the splicing of introns from pre-mrna during the post-transcriptional modification of RNA snrnps are made up of small nuclear RNA (snrna) and a group of seven proteins known as Sm ribonucleoproteins that make up the extremely stable Sm core of the snrnp How do SMN proteins assemble these U snrnp complexes? 4

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64 Splicing alternativo Nel gene DSCAM di drosofila gli ipotetici mrna alternativi sono circa 38,000

65 Errori di splicing Uno esone può essere saltato Si possono usare siti criptici

66 Splicing alternativo La troponina dà luogo a due forme con due esoni diversi: o il 3 o il 4 In genere le alternative possono essere costitutive o regolate

67 Splicing alternativo Ci sono almeno 5 modi diversi di fare splicing alternativo

68 Esempio di Splicing alternativo regolato Repressori: intronicexonic splicing silencers (ESS o ISS). Si legano a hnrnp (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) e non hanno il dominio SR per il legame a U1 o U2AF. Bloccano i siti di enhancer Gli attivatori (ESE o ISE) riconoscono una sequenza specifica e col dominio RS reclutano i fattori di splicing

69 hnrnpi è un inibitore dello splicing Nasconde gli esoni con due meccanismi unendo le regioni fiancheggianti l esone, coprendo cooperativamente l esone.

70 La definizione di gene cambia con la scoperta dello splicing alternativo dell mrna?

71 RNA Editing Definition: any process, other than splicing, that results in a change in the sequence of a RNA transcript such that it differs from the sequence of the DNA template Discovered in trypanosome mitochondria K. Stuart L. Simpson Also common in plant mitochondria Also occurs in a few chloroplast genes of higher plants, and at least a few nuclear genes in mammals

72 RNA editing Rappresenta un altro modo per modificare la sequenza di un mrna deamminazione sitospecifica (CU o A Inosina) Inserzione o delezione di U diretta da RNA guida

73 Editing con inserzione di U, mediato da RNA guida Forma trovata nel mitocondrio di tripanosoma Vengono aggiunte delle U, modificando il frame di lettura. I RNA guida (grna) hanno un ancora di attacco al 5, la regione di editing ed un tratto poli-u al 3.

74 Meccanismo Il grna si attacca con l ancora Induce la formazione di anse sul mrna da modificare Taglio endonucleasico Inserimenti di U da parte di uridil-transferasi 3 terminale (TUTasi) Poi la Ligasi. Il tratto PoliU potrebbe aumentare la complementarietà dell attacco. Lo stesso grna può modificare siti diversi

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76 Esempio di deamminazione sito-specifica Gene dell apolipoproteina-b umana. La deamminazione, introduce uno stop codon, e quindi una proteina troncata

77 PRE-mRNA mrna END MODIFICATIONS - CAP - polya FUNCTIONS Transport to cytoplasm, initiation of translation Termination transcription, init transl, turnover Splicing No role other than removal of introns Alternative splicing Enables one RNA to code for two proteins RNA editing Enables one RNA to code for two proteins Converts abbreviated transcripts in functional RNAs Places termination codons in some mitoch mrnas

78 Il significato dell editing dell mrna -correggere errori del genoma? -produrre in maniera casuale proteine nuove? -meccanismo di difesa contro retrovirus?

79 Il trasporto del mrna mrna maturo (con capping, splicing, PoliA e proteine aggiunte) viene rilasciato dal nucleo con un meccanismo regolato Attrevarso il poro nucleare, che usa la GTPasi Ran.