14. La trascrizione eucariotica

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1 14. La trascrizione eucariotica contiene materiale protetto da copyright, ad esclusivo uso personale; non è consentita diffusione ed utilizzo di tipo commerciale Differenze procarioti ed eucarioti PROCARIOTI Su stampo di DNA RNA pol legge sequenza di DNA per cercare e legare promotore EUCARIOTI Su stampo di cromatina RNA pol NON può leggere DNA e diversi fattori cis- agenti devono legarsi al DNA prima dell RNA pol 1

2 mrna di procarioti ed eucarioti informazioni per più geni informazioni per 1 solo gene 2

3 RNA polimerasi degli eucarioti RNA polimerasi eucariotiche hanno molte subunità Core: RPB1, RPB- 2 e RPB- 3 RPB 5, 6,8,10, 12 comuni a tutte le pol RPB 4 e RPB9 non essenziali. 3

4 Confronto tra la cos,tuzione in subunità delle tre RNA polimerasi degli eucario, e la RNA polimerasi di E coli. C- terminal domain (CTD) è coinvolto nell inizio della trascrizione 4

5 Promotori 5

6 definiti da tecnica dell impronta o analisi mutazionale Sistemi usati per careatterizzare un promotore: ovociti di X. Laevis trasfezione animali transgenici sistemi in vitro 6

7 . Promotore batterico (A) e promotori delle tre polimerasi eucariotiche Pol I Pol II Unicell Pol II Multicell Pol III trna Pol III rrna 7

8 promotore della RNA polimerasi I Composto da due sequenze Nucleo del promotore (da - 45 a +20): ricca in GC, tranne una sequenza ricca in AT vicina all inizio vi si lega un fattore formato da 4 proteine (tra cui TBP) Elemento a monte del promotore (da a 107) vi si lega la proteina UBF (Upstream Binding Factor). promotore della RNA polimerasi I 8

9 promotori della RNA polimerasi III Tipo 1: Tipo 2: Formazione del complesso di pre-inizio Tipo 1 9

10 Formazione del complesso di pre-inizio Tipo 2 promotore della RNA polimerasi II Promotore minimo 10

11 MA ANCHE più complessi ed estesi Formazione del complesso di Pre- Inizio (PIC) della RNA polimerasi II 11

12 TBP lega il DNA nel solco minore Formazione del complesso di Pre- Inizio (PIC) della RNA polimerasi II 12

13 CTD può essere coinvolto nelle modificazioni dell RNA dopo la sua sintesi da parte di RNA pol II (A) Capping enzyme (CE) is recruited to the vicinity of nascent mrna by the CTD phosphorylated on Ser5. (B) During transcription, the CTD is phosphorylated on Ser2, while the Ser5- P is dephosphorylated and is involved in recruiting the indicated splicing factors, which defines splice sites and facilitates assembly of the spliceosome. Genes & Dev :

14 Modello della strubura del complesso di pre- inizio Kornberg (2007), «The molecular basis of eukaryo<c transcrip<on», Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14

15 Enhancer Gli enhancer possono funzionare in diversi modi 15

16 Enhancer Contengono gli stessi elementi che si trovano nei promotori differenza tra enhancer e promotore è data dalla densità dei motivi di sequenza. CARATTERISTICHE DEGLI ENHANCERS: 1) LUNGHI DA 50 A 150 bp. 2) SE TOLTI DA UN PROMOTORE E POSTI NELLE VICINANZE DEL PROMOTORE DI UN GENE COMPLETAMENTE DIFFERENTE AGISCONO ANCORA. 3) AGISCONO ANCHE SE POSTI ALL INTERNO DI UN GENE (IN UN INTRONE) O ALL ESTREMITA 3 DEL GENE. 4) AGISCONO ANCHE SU GENI DISTANTI MIGLIAIA DI bp 5) AGISCONO IN ENTRAMBE LE DIREZIONI (CIOE SU GENI POSTI SU ENTRAMBI I FILAMENTI DI DNA). 16

17 MA GLI ENHANCERS POSSONO FUNZIONARE IN MODO SPECIFICO SOLO IN UN DETERMINATO TIPO CELLULARE: ex. GENI DELLE IG SI LEGANO TF PRESENTI IN MOLTI TIPI CELLULARI NEI LINFOCITI B SI LEGA UN TF CHE ATTIVA LA TRASCRIZIONE MENTRE IN TUTTE LE ALTRE CELLULE SE NE LEGA UNO DIFFERENTE CHE LA INIBISCE SI LEGANO TF PRESENTI SOLO NEI LINFOCITI B GLI ATTIVATORI LEGANO L ENHANCER IN MODO COOPERATIVO COSI DA FORMARE UNA STRUTTURA DETTA ENHANCEOSOMA Ex. Gene dell interferone beta 17

18 Ruolo degli isolatori. 18

19 Dominio di regolazione 19

20 Struttura modulare e domini dei fattori di trascrizione (trans- attivatori) L attività di un promotore è influenzata dalla Metilazione del DNA HpaII taglia CCGG solo se NON metilata MspI taglia CCGG sempre 20

21 What CpG islands are? CpG dinucleotides are rare in mammal DNA DNA Methylation only occurs at CpG sites Methylated cytosines may be converted to thymine by deamination over evolution CpG à TpG CpG islands are short stretches of DNA with higher frequency of the CG sequence Usually they are not methylated 21

22 What CpG islands are? Definition from Gardiner-Garden & Frommer At least 200 bases long G+C content: > 50% observed CpG/expected CpG ratio: >= 0.6 Definition from Takai & Jones Longer than 500 bp G+C content: > 55% observed CpG/expected CpG ratio: >= 0.65 With this definition, these CpGi s are more likely to be associated with the 5 regions of genes and exclude most Alu s There are about 29,000 such regions in the human genome CpG islands & Genes CpG islands located in the promoter regions of genes can play important roles in gene silencing Housekeeping genes Almost all housekeeping genes are associated with at least one CpG island CpG islands are starting 5 to the transcription start site and covering one or more exons and introns Tissue specific genes About 40 % tissue specific genes are associated with islands The position of these islands is not strongly toward the transcription start site as in the housekeeping genes 22

23 CpG islands & Genes Not all CpG islands are associated with genes Ioshikhes & Zhang determined the features to discriminate the promoter-associated and non-associated CpG islands There are methylation-prone and methylation-resistant CpG islands Feltus et. al. found patterns to discriminate methylation-prone from methylation-resistant CpG islands 5 end CpG islands & Genes CpGi Gene Gene Promoter CpG islands Gene CpG islands in body Gene 3 end CpG islands 23

24 Isole CpG Nota la sequenza genomica è possibile predire la localizzazione delle isole GpG con programmi bioinformatici. La definizione operativa che viene comunemente utilizzata per la definizione di un isola CpG nei mammiferi è la seguente: - L > 200 bp - C+G% > 50% - CpG Obs/Exp > 0.6 CpG Obs/Exp = f (CG) / f (C) x f (G) 24

25 Sotto è rappresentata una micrografia elettronica di un gene che viene trascritto. Il filamento di DNA orizzontale con trascritti di RNA che si estendono verticalmente verso l esterno i. Disegna una freccia per indicare la direzione del movimento dell RNA polimerase lungo il filamento di DNA. Perché hai scelto questa direzione? ii. Questa è la sequenza parziale del gee che è stato trascritto orientato nella stessa direzione mostrata nello schema. Quale filamento è lo stampo? Quello sopra o quello sotto? Spiega 5 ACTCGATGCTAG3 3 TGAGCTACGATC5 iii. Scrivi la sequenza dell mrna che viene trascritto e indica 5 e 3 5 CUAGCAUCGUCGAGU3 b) Questo schema mostra la localizzazione cromosomica del Gene 1 e del Gene 2 con i corrispondenti promotori p1 e p2. i. La direzione della trascrizione sarà la stessa per i due geni? Spiega ii. Mostra la direzione della trascrizione per i due geni disegnando delle frecce iii. Circonda su ogni gene le regioni dove molto probabilmente si legheranno i fattori di trascrizione 25