Flusso dell informazione genetica

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1 Flusso dell informazione genetica 1

2 Trascrizione dell RNA (1) Topoisomerasi La trascrizione è catalizzata dalla RNA polimerasi diretta dal DNA con un meccanismo molto simile alla DNA polimerasi Differenze con la DNA polimerasi: non ha bisogno del primer non ha una efficace attività di proofreading 2

3 Trascrizione dell RNA (2) Per convenzione la sequenza di riferimento utilizzata per indicare una gene è quella non-stampo (detta impropriamente codificante). In realtà la catena che codifica per l RNA è quella che va in direzione 5 3 In alcuni virus (es: adenovirus) entrambe la catene codificano proteine 3

4 Trascrizione dell RNA (3) Il corretto posizionamento dalla RNA polimerasi sulla catena stampo è guidato da specifiche sequenze consenso denominate promotori Promotori eucariotici Promotori procariotici 4

5 Trascrizione dell RNA nei procarioti (1) s Le fasi della trascrizione (E. coli) Fase di legame Interazione RNA polimerasi con il promotore (complesso chiuso) Svolgimento del DNA da -10 a + 3 o +5 (complesso aperto) Fase di inizio Inizio della trascrizione; dopo 8-9 nucleotidi sintetizzati viene rilasciata la subunità sigma (s). Prosecuzione della sintesi dell RNA s Il sito di inizio della trascrizione è finemente regolato ( vedi lac operon) 5

6 Trascrizione dell RNA nei procarioti (2) Fase di terminazione r-indipendente Formazione nella regione terminale di un ibrido DNA-RNA instabile per la presenza di molte coppie A=U Formazione di una struttura a forcina per la presenza di nucleotidi complementari che destabilizzano definitivamente l ibrido DNA-RNA con conseguente rilascio dell mrna trascritto r-dipendente Presenza di una proteina r con attività elicasica che promuove il distacco dell RNA dal DNA 6

7 Trascrizione dell RNA negli eucarioti La trascrizione negli eucarioti è molto complessa e ancora non ben chiarita Tre RNA polimerasi RNA polimerasi I (Pol I): sintesi pre-rrna RNA polimerasi II (Pol II): sintesi mrna 12 subunità 6 fattori di inizio 4 fattori di allungamento RNA polimerasi III (Pol III): sintesi trna, rrna 5S 7

8 Inibitori della trascrizione L actinomicina D e l acridina sono due antibiotici che agiscono sia nei batteri che negli eucarioti. La parte colorata planare si lega tra due successivi appaiamenti G C del DNA provocando una deformazione che non permette alla RNA polimerasi di trascrivere. La rinfampicina si lega alla RNA polimerasi batterica impedendo la trascrizione(antibatterico) L a-amanitina, presente nel fungo Amanita phalloides, inibisce fortemente la Pol II causando la morte degli organismi animali. 8

9 Trascrizione procarioti & eucarioti (1) 9

10 Trascrizione procarioti & eucarioti (2) mrna procariotico Prevalentemente policistronico mrna eucariotico Prevalentemente monocistronico 10

11 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (1) 11

12 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (2) Incappucciamento dell mrna 12

13 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (3) Poliadenilazione (inserimento della coda ) Formazione del legame tra la sequenza segnale (AAUAAA) e il complesso enzimatico Scissione in una posizione tra 11 a 30 nucleotidi da AAUAAA Sintesi della coda poli(a) lunga da 80 a 250 nucleotidi 13

14 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (4) 14

15 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (5) 15

16 Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti (6) 16

17 Modificazioni post-trascrizionali del rrna 17

18 Modificazioni post-trascrizionali del trna 18

19 Attività catalitica dell RNA (Ribozimi) L esistenza di RNA catalitici e l interconversione di RNA a DNA (vedi retrovirus con trascrittasi inversa) hanno portato all ipotesi che la prima fase dell evoluzione biologica sia stata la comparsa dell RNA (o di un polimero equivalente) in grado di catalizzare la sua stessa replicazione Bibliografia: Bittker,J.A., et. al. Curr. Opin.Chem.Biol. 6, (2002) Johston, W.K, et al. Science, 292, (2001) Joyce, G. E. Nature, 418, (2002) Wilson, D.S. et al. Annu.Rev.Biochem. 68, (1999) Yarus, M. Ann. Rev. Genet, 36, (2002) 19

20 Sintesi RNA e DNA, dipendente dall RNA Espansione del dogma centrale della biologia per includere la sintesi RNAdipendente di RNA e DNA 20

21 Retrovirus & trascrittasi inversa (1) I retrovirus hanno una DNA polimerasi dipendente dall RNA ( trascrittasi inversa ) che produce DNA a partire dal loro RNA RNA virale Ibrido RNA-DNA trascrittasi inversa trascrittasi inversa cdna (DNA complementare) integrasi Integrazione nel DNA della cellula ospite 21

22 Retrovirus & trascrittasi inversa (2) Le trascrittasi inverse non hanno attività esonucleasica 3 5 con funzione proofreading Ciò comporta una frequenza di errore di 1 ogni nucleotidi aggiunti con conseguente continua mutazione del virus Le trascrittasi inverse sono diventate importanti nel clonaggio molecolare in quanto rendono possibile la sintesi in laboratorio a partire dall RNA (DNA complementare, cdna) 22

23 Retrovirus & cancro Genoma del sarcoma di Rous (o aviario) In seguito a ricombinazione con il genoma di un retrovirus e successive mutazioni, si possono generare degli oncogeni (evento raro) codificanti per proteine che provocano una incontrollata riproduzione cellulare (tumore) 23

24 Retrovirus & AIDS Genoma dell HIV geni sovrapposti Piccolo genoma (9,7x10-6 nucleotidi) che grazie a meccanismi di splicing alternativo causano la produzione di molte proteine diverse 24

25 Chemioterapia con analoghi purinici e pirimidinici L analogo viene somministrato come base libera o nucleoside (pro-farmaco) perche il nucleotide farmacologicamente attivo essendo carico non riesce ad attraversare la membrana biologica Analogo

26 RNA Azione farmacologica dell AZT DNA CTP UTP dctp dutp dttp dazttp CDP UDP dcdp dudp dtdp daztdp CMP UMP de novo dcmp dump dtmp daztmp H 2 O NH 3 H 2 O NH 3 CR UR CdR UdR TdR AZTdR Membrana cellulare U 3 -azido-2,3 -dideossi-timidina (AZT) HO-CH 2 H H O T Timina H H AZT N=N=N H