Come si replica il DNA

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1 Come si replica il DNA

2 Filamenti figli Replicazione semiconservativa Filamento parentale Un emielica di DNA funziona da stampo per la sintesi di un nuovo filamento Filamento parentale

3 L enzima DNA polimerasi catalizza la formazione del legame estere aggiungendo nucleosidi trifosfati all estremità 3 -OH di una emielica di DNA; pertanto la direzione di sintesi è sempre 5-3

4 La DNA polimerasi necessita di un innesco o primer : breve sequenza di RNA sintetizzata dall enzima primasi -filamento anticipato ( leading ) sintetizzato in modo continuo - filamento in ritardo ( lagging ) sintetizzato in modo discontinuo (frammenti di Okazaki) sullo stampo 5-3.

5 DNA polimerasi La formazione del legame fosfodiestere avviene solo in direzione 5 3 In direzione 3 5 si svolge l attività di correzione delle bozze necessaria per rimuovere nucleotidi erroneamente inseriti, permettendo cosi una replicazione fedele del DNA

6 Sadava, Heller, Orians,Purves, Hillis Biologia Zanichelli Il complesso di duplicazione : una macchina molecolare composta da molte proteine che si lega in corrispondenza delle sequenze ori (origine della replicazione ) permettendo lo scorrimento del DNA e la sua replicazione in entrambe le direzioni (due forcelle di replicazione

7 La replicazione del DNA nel cromosoma circolare procariotico (unica origine di replicazione) e nei cromosomi lineari eucariotici (diverse origini di replicazione per ogni cromosoma). La replicazione del DNA è sempre bidirezionale

8 REPLICAZIONE delle sequenze telomeriche La rimozione del primer di RNA sull estremità 5 del filamento in anticipo neozintetizzato produce molecole di DNA con estremità 5 più corte rispetto alla molecola di partenza Alle due estremità della doppia elica del DNA in tutti i cromosomi eucariotici sono presenti sequenze ripetute di eterocromatina costitutiva con alto numero di copie (nell uomo TTAGGG con ripetizioni ) che impediscono l erosione dei geni codificanti

9 Ad ogni ciclo replicativo i telomeri di tutti i cromosomi lineari si accorciano determinando l invecchiamento della cellula e la morte per APOPTOSI Solo le cellule che possiedono la TELOMERASI (cellule del midollo osseo, cellule della linea germinale, molti tipi di cellule tumorali) non presentano accorciamento dei telomeri. La telomerasi (scoperta nel 1989 nel protozoo Tetrahymena ) è una molecola composta da proteine e RNA (ribozima) il quale funziona da stampo per la sintesi di DNA ovvero per l aggiunta della sequenza telomerica deteminando così l allungamento dei telomeri

10 TRASCRIZIONE : sintesi di RNA DNA Il flusso dell informazione genetica : dai geni alle proteine, dal genotipo al fenotipo trna Amino-acidi Aminoacil- trna mrna TRADUZIONE : sintesi di proteine ribosomi rrna Proteine ribosomali Polipeptidi Assemblaggio Proteina

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12 Trascrizione e Traduzione in procarioti ed eucarioti eucarioti procarioti Nei procarioti trascrizione e traduzione sono eventi accoppiati grazie all assenza di membrana nucleare. Negli eucarioti il trascritto primario (pre-mrna) subisce una serie di processamenti nel nucleo; l RNAm maturo viene tradotto nel citoplasma campbell

13 Sintesi dell RNA catalizzata dall enzima RNApolimerasi L RNA polimerasi ha direzione di sintesi 5-3. I precursori sono nucleosidi trifosfati L RNA sintetizzato è antiparallelo al filamento di DNA stampo

14 Per la trascrizione di un gene/regione un solo dei due filamenti di DNA è letto : il filamento stampo. Il filamento di DNA non utilizzato come stampo viene definito filamento codificante, perché ha la stessa sequenza dell RNA trascritto

15 Le tre fasi della Trascrizione Promotore sequenza nucleotidica di un gene a cui si lega l RNA polimerasi per iniziare la trascrizione. Procarioti - promotori con sequenze consenso - unico promotore per geni contigui (p.e. operone lac ) - un unico tipo di RNA pol. Eucarioti -promotori con sequenze consenso (TATA box) - tre tipi di RNA pol. -necessità di fattori di trascrizione 1 : Inizio (terminatore) 2 : Allungamento 3 : Terminazione

16 La maturazione del trascritto primario (pre-mrna) in eucarioti

17 Nelle cellule eucariotiche : -Sono presenti tre tipi di RNA polimerasi (I per rrna, II per mrna, III per trna) - i geni sono discontinui (esoni intervallati da introni) - l RNA trascritto primario viene modificato (maturato) attraverso i seguenti processi : rimozione delle sequenze introniche : splicing dell RNA ad opera dello spliceosoma composto da proteine e snrna (ribozima ) aggiunta di una guanina modificata all estremità 5 : cappuccio al 5 aggiunta di una sequenza di adenine all estremità 3 : coda di poli-a

18 L importanza funzionale ed evolutiva degli introni Una delle funzioni degli introni è quella di permettere la codificazione di proteine diverse a partire da un unico gene attraverso il meccanismo di splicing alternativo. Infatti i siti di splicing possono essere attivi o disattivati a seconda del tipo di cellula o tessuto. Questo è uno dei motivi per cui il genoma umano in cui sono presenti circa geni è in grado di codificare circa polipeptidi

19 Il codice genetico è l insieme di regole che permettono la corrispondenza tra sequenze nucleotidiche e aminoacidiche

20 Il codice genetico : * strutturato a triplette/codoni (tre nucleotidi un aminoacido ) * ridondante/degenerato (codoni diversi ma sinonimi stesso aminoacido) * non ambiguo (un codone un unico aminoacido) * continuo e senza sovrapposizioni * codoni di inizio e di fine traduzione * è universale

21 Il codice genetico e le conseguenze dei vari tipi di mutazioni geniche puntiformi Mutazioni per sostituzione nucleotidica silente neutra missenso o di senso non senso effetto sulla sequenza aminoacidica Nessuno (conseguenza della degenerazione o ridondanza del codice ) cambia un aminoacido e viene mantenuta la funzione cambia un aminoacido e viene perduta la funzione sequenza incompleta : proteina tronca e non funzionante

22 MUTAZIONE per inserzione/delezione di 1-2 nucleotidi frame-shift (scorrimento della cornice di lettura ) : cambiamento di molti aminoacidi Inserzione di 3 nucleotidi/ Delezione di 3 nucleotidi : Inserzione di un aminoacido - Delezione di un aminoacido N.B.Negli eucarioti mutazioni negli introni possono avere conseguenze : p.e. comparsa di un nuovo sito di splicing in seguito a mutazione per sostituzione o delezione/inserzione

23 TRADUZIONE : dalla sequenza di RNAm alla sequenza polipeptidica

24 Struttura dei trna (RNA transfer) Reazione di attivazione dell aminoacido aminoacido OH estremità 3 estremità 5 Aminoacido (fenilalanina) Aminoacido + trna AminoaciltRNA Anticodone Aminoacil-tRNA SINTETASI

25 I ribosomi sono composti da proteine e da RNA ribosomale e sono formati da due subunità Sadava - Zanichelli Amminoacido polipeptide exit Le due subunità ribosomali sono separate quando il ribosoma non è impegnato nella sintesi proteica

26 Inizio raduzione

27 Allungamento della catena polipeptidica Sadava

28 Terminazione della traduzione e rilascio della catena polipeptidica completa

29 Smistamento delle proteine e modificazioni post-traduzionali nelle cellule eucariotiche In relazione alla destinazione della proteina codificata I ribosomi impegnati nella sintesi proteica rimangono liberi nel citoplasma o si legano al Reticolo Endoplasmatico (ribosomi legati al RE ) I ribosomi liberi sintetizzano le proteine destinate al nucleo, ai mitocondri, ai perossisomi e ai cloroplasti I ribosomi legati al RE sintetizzano le proteine secrete dalla cellula, le proteine della membrana plasmatica, dell apparato di Golgi e dei lisosomi

30 Le nuove frontiere della genetica: DNA ricombinante e sue possibili applicazioni biotecnologiche. Biotecnologie : utilizzazione di cellule e di organismi viventi per produrre o per modificare materiali e processi utili agli esseri umani. Le biotecnologie comprendono le TECNOLOGIE DEL DNA RICOMBINANTE che hanno vaste applicazioni in molti campi compreso quello biomedico Esempi di obiettivi rilevanti delle tecnologie del DNA ricombinante : - individuare, isolare, analizzare, sequenziare, amplificare ( clonare ovvero ottenere molte copie ) sequenze di DNA di interesse p.e. sequenze geniche mutate in malattie ereditarie o altri tipi di patologie caratterizzate da mutazioni somatiche (come i tumori); -trasferire sequenze di DNA da un organismo a un altro della stessa specie o di specie anche molto diverse (organismi transgenici o Organismi Geneticamente Modificati) allo scopo di far acquisire agli individui riceventi proprietà e comportamenti che prima non aveva.

31 ENZIMI di RESTRIZIONE : sono i principali strumenti delle tecnologie del DNA ricombinante in quanto in provetta tagliano qualunque tipo di DNA in specifiche sequenze palindromi* producendo frammenti di restrizione di lunghezza variabile Esempio di sequenza palindrome : 5.AACGTT.3 3 TTGCAA..5 I frammenti di restrizione possono essere separati in base al loro p.m. utilizzando la tecnica dell elettroforesi su gel Un gel contenente frammenti di DNA separati. Ogni corsia è relativa a un campione di DNA (p.e. ottenuto da cellule di diversi individui) Si ottiene così il profilo genetico (DNA fingerprinting ovvero impronte del DNA ) che è specifico per ogni individuo in quanto c è variabilità interindivuale per le sequenze di DNA. P.e. variazioni ai siti di restrizione generano frammenti di restrizione con lunghezza diversa da individuo a individuo

32 Dei 7 individui sospettati del crimine, quale è il colpevole?

33 Sequenze di DNA umano possono essere inserite in un plasmide ovvero un vettore e trasferite in cellule batteriche Plasmide ricombinante Cellule transgeniche sintetizzano grandi quantità del prodotto di un transgene Cellula transgenica

34 Il risultato di questo tipo di tecnologie è la produzione di proteine umane di interesse : farmaci ricombinanti come insulina, interferoni, alcuni vaccini (p.e. vaccino per epatite B, per papilloma virus,responsabile del tumore al collo dell utero ecc.)

35 La reazione a catena della polimerasi (PCR) : clonaggio del DNA in vitro Permette di amplificare in vitro una sequenza di DNA presente anche in piccolissime quantità all interno di un insieme eterogeneo di molecole di DNA (applicazioni in medicina legale e in numerosi altri campi della medicina) La tecnica è basata su : - cicli di denaturazione ad alta temperatura della molecola di DNA di interesse, - uso di primer, sequenze di RNA oligonucleotidiche complementari alle sequenze fiancheggianti della sequenza da amplificare, - sintesi di DNA catalizzata dall enzima termostabile Taq polimerasi ottenuto da un procariote Archaea