Quanto DNA è contenuto in una cellula?...

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1 Quanto DNA è contenuto in una cellula?... bp = Base Pair (coppie di basi) lungh DNA/lungh struttura ospitante E. coli: 4,6x10 6 bp (1,7 mm) 850 (unica molecola circolare) Cellula umana: 3,2x10 9 bp (~2 m) ~4x10 5 (46 cromosomi) Modalità di compattamento del DNA: - Superavvolgimento - associazione con proteine in strutture ordinate

2 Superavvolgimento DNA rilassato

3 -Superavvolgimento negativo (rotazione nella direzione opposta all avvolgimento dell elica) -Superavvolgimento positivo (rotazione nella stessa direzione di avvolgimento dell elica) Il superavvolgimento positivo compatta il DNA e rende più difficile la separazione dei filamenti dell elica Il superavvolgimento negativo deriva dal parziale srotolamento della doppia elica e facilita la separazione dei filamenti dell elica Il DNA è mantenuto in uno stato superavvolto perché le catene non sono libere di ruotare su se stesse (DNA circolare, nei procarioti associazione con proteine, negli eucarioti)

4 è richiesta la separazione dei filamenti dell elica

5 La separazione dei filamenti dell elica induce superavvolgimento positivo

6 I superavvolgimenti generati dalla separazione dei filamenti dell elica durante la replicazione o la trascrizione vengono rimossi dalle DNA topoisomerasi

7 Come funzionano le TOPOISOMERASI? TOPOISOMERASI DI TIPO I - Monomeri - Tagliano un singolo filamento - Non consumano ATP TOPOISOMERASI DI TIPO II - Omodimeri (eucarioti) eterotetrameri (batteri) - Tagliano entrambi i filamenti - richiedono ATP Tutte le topoisomerasi formano un intermedio covalente enzima-dna

8 In una cellula umana, 2 m di DNA sono impacchettati in un nucleo di pochi μm di diametro! DNA + proteine = cromatina cromosomi

9 DNA nucleosomale: 146 bp + 60 bp (linker) Istoni: proteine basiche (ricche in Lys e Arg) L interazione con il DNA è di tipo elettrostatico e sequenza-indipendente

10 Livelli di organizzazione della cromatina In una cellula umana, 2 m di DNA sono impacchettati in un nucleo di pochi µm di diametro!

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12 Molecular Visualizations of DNA.flv

13 Il legame fosfodiestere può essere idrolizzato da nucleasi (fosfodiesterasi) -Ribonucleasi (RNAasi) -Deossiribonucleasi (DNAasi) -enzimi di restrizione = endonucleasi sequenza-specifiche

14 Il legame fosfodiestere può essere idrolizzato da nucleasi Ribonucleasi (RNAasi) Deossiribonucleasi (DNAasi) endonucleasi

15 La replicazione del DNA Caratteristiche: -Semiconservativa -Bidirezionale -Fedele -Semidiscontinua Principali enzimi coinvolti: -DNA polimerasi -DNA ligasi -Primasi -Elicasi -Topoisomerasi

16 Nei procarioti la replicazione del DNA inizia in un unico sito (origine della replicazione) Negli eucarioti la replicazione inizia in più siti Sia nei procarioti che negli eucarioti la replicazione è bidirezionale Forcella di replicazione: Biforcazione ad Y che corrisponde alla zona in cui avanza la replicazione

17 Inizio della replicazione nei procarioti

18 Inizio della replicazione nei procarioti

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21 EFFETTO DI PROTEINE CHE LEGANO IL FILAMENTO SINGOLO SULLA STRUTTURA DEL DNA

22 La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi LA DNA POLIMERARI CATALIZZA L AGGIUNTA SEQUENZIALE DI UN DEOSSIRIBONUCLEOTIDE ALL ESTREMITA 3 -OH DI UNA CATENA POLINUCLEOTIDICA ACCOPPIATA AD UN FILAMENTO STAMPO -Stampo (DNA) n residui +dntp (DNA) n+1 +PPi -3 -OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5 -trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -Mg 2+

23 Struttura della DNA polimerasi

24 La sintesi delle nuove molecole di DNA è catalizzata da DNA polimerasi La replicazione semiconservativa del DNA comporta la formazione di legami covalenti tra un deossinucleoside trifosfato entrante ed il terminale 3 del deossiribosio di un nucleotide pre-esistente. Da ciò consegue che la direzione di replicazione del DNA procede sempre nella direzione 5 3 (relativamente alla polarità del nucleotide entrante).

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29 Che cosa è richiesto per la replicazione del DNA. -Stampo -3 -OH libero (innesco/catena in allungamento) -Nucleosidi 5 -trifosfato (tutti e quattro i nucleotidi devono essere presenti) -DNA polimerasi -Mg 2+ La replicazione è un processo molto accurato (replicazione fedele) Frequenza di errore in E. coli: 1 errore ogni nucleotidi aggiunti (1 errore ogni replicazioni!)

30 Correzione degli errori: attività proofreading 3 5 esonucleasica della DNA Polimerasi I

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32 La DNA polimerasi -Richiede un innesco per la sua attività -Sintetizza DNA in direzione 5 5 3

33 Problema 1: chi fornisce l innesco?... Soluzione: DNA primasi: è una RNA polimerasi che sintetizza un breve tratto di RNA (circa 10 nucleotidi) complementare allo stampo di DNA (RNA primer). La DNA primasi utilizza ribonucleosidi 5 - trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestere liberando PPi La DNA polimerasi aggiunge poi deossiribonucleotidi all estremità 3 -OH del RNA primer La DNA polimerasi utilizza deossiribonucleotidi 5 -trifosfato e catalizza la formazione del legame fosfodiestereo liberando PPi

34 Problema 2: poiché i due filamenti sono antiparalleli, la crescita dei filamenti neosintetizzati deve avvenire in direzioni opposte

35 Soluzione al problema 1: -Sintesi continua nella direzione di avanzamento della forcella di replicazione (filamento guida/catena veloce) -Sintesi discontinua nella direzione di allontanamento dalla forcella di replicazione (catena lenta: frammenti di Okazaki) La replicazione del DNA è semidiscontinua

36 FRAMMENTI DI OKAZAKI Il terminale 3' del filamento guida (leading strand) è sintetizzato in modo continuo, mentre il terminale 5' del filamento in ritardo (lagging strand) è sintetizzato in modo discontinuo con i frammenti di Okazaki. Nuovi frammenti di Okazaki si inseriscono a mano a mano che la forcella di replicazione si apre, fino ad estendersi a tutta l'elica da replicare.

37 a) Ad intervalli, la DNA primasi sintetizza un primer di RNA per un nuovo frammento di Okazaki. La sintesi della catena lenta procede nel senso opposto a quello della forcella. b) Ciascun primer viene esteso dalla Polimerasi III. a) La sintesi di DNA continua finchè il frammento si estende fino ad incontrare il primer del frammento di Okazaki sintetizzato in precedenza. A questo punto un nuovo primer viene sintetizzato vicino alla forcella di replicazione per iniziare nuovamente il processo

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39 Fase di sintesi/allungamento Limits of DNA polymerase can only build onto 3 end of an existing DNA strand 3 5 Okazaki fragments 3 5 ligase Okazaki Lagging strand 5 growing replication fork Lagging strand Okazaki fragments joined by ligase 3 DNA polymerase III Leading strand Leading strand continuous synthesis

40 Replication leading lagging coupling - YouTube(2)

41 La duplicazione del DNA nei Procarioti La DNA polimerasi I (Pol I) di E. coli ha le seguenti attività: Attività polimerasica 5 3 : sintesi DNA Attività esonucleasica 3 5 : correzione basi sbagliate inserite Attività esonucleasica 5 3 : riparazione DNA (rimozione basi in porzioni danneggiate del DNA) N 5 3 esonucleasica 3 5 esonucleasica Polimerasi C

42 Attività esonucleasica 5 3 rimozione frammenti di Okazaki Il primer di RNA all estremità 5 di un frammento di Okazaki viene eliminato grazie all attività esonucleasica 5 3 della Pol I e sostituito mediante la sua attività polimerasica 5 3. Il legame covalente è ripristinato ad opera della DNA ligasi

43 Rimozione del primer e sostituzione con un tratto di DNA da parte della DNA polimerasi I

44 Quante DNA polimerasi?...replicazione ricombinazione riparazione Processività = numero di nucleotidi aggiunti prima che la polimerasi si dissoci Velocità di replicazione in E. coli = circa 1000 nucleotidi/sec Enzima principale della replicazione riparazione

45 Saldatura dei frammenti di Okazaki DNA LIGASI La DNA ligasi catalizza l unione di una catena di DNA la cui estremità libera contiene un gruppo ossidrilico in posizione 3 (3 -OH) con un altra catena la cui estremità libera contiene un gruppo fosforico in posizione 5 (5 -P). Reazione a più passggi 1.Attivazione del gruppo fosforico 5 al punto di interruzione 2. Formazione del legame fosfodiestereo

46 Reazione catalizzata dalla DNA ligasi: 1. Attivazione del gruppo fosforico 5 al punto di interruzione: 1a) trasferimento di AMP ad un residuo di lisina dell enzima (nota: l AMP può derivare dal NAD + o dall ATP)

47 1b) trasferimento dell AMP dall enzima al gruppo fosforico 5

48 Reazione catalizzata dalla DNA ligasi: 1. Attivazione del gruppo fosforico 5 al punto di interruzione 2. Il gruppo 3 -OH si lega al gruppo fosforico attivato e sposta l AMP. si forma il legame fosfodiestereo con eliminazione dell interruzione

49 La coordinazione della sintesi dei due filamenti è garantita dalla peculiare struttura della DNA polimerasi III

50 Replisoma: l intero complesso di proteine alla forcella di replicazione

51 DNA Replication.flv

52 TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE Origine Forcella in senso antiorario Forcella in senso orario Trappola per la forcella in senso orario Trappola per la forcella in senso antiorario

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54 Negli Eucarioti la replicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare

55 LA DIVISIONE DEL NUCLEO PER MITOSI CONSTA DI QUATTRO FASI: PROFASE, METAFASE, ANAFASE, TELOFASE

56 Impiego biotecnologico delle DNA polimerasi Trascrittasi inversa Frammento di Klenow DNA polimerasi termostabili nelle reazioni di PCR (Taq polimerasi, Pfu polimerasi) Impiego di inibitori delle DNA polimerasi come farmaci Aciclovir (antivirale, inibitore e terminatore di catena)